Hic-5在小鼠2-3肝切除后的表達(dá)變化及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1、通過(guò)建立C57BL/6小鼠2/3肝切除動(dòng)物模型，檢測(cè)Hic-5在肝再生過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。
　　2、研究Hic-5動(dòng)態(tài)變化與肝細(xì)胞再生之間的相關(guān)關(guān)系及可能機(jī)制。
　　方法:
　　1、選取40只8-10周齡雄性健康C57BL/6小鼠，體重約20-25g，飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房中。利用分葉順次肝大部切除技術(shù)建立小鼠2/3肝切除后肝再生動(dòng)物模型。
　　2、分別于術(shù)后0h、12h、24 h、36

2、h、48 h、72 h、120 h、168 h，8個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集血液和肝組織標(biāo)本，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只小鼠。
　　3、血清學(xué)標(biāo)本采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)肝切后不同時(shí)間點(diǎn)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的表達(dá)變化情況;各時(shí)間點(diǎn)肝臟組織行HE染色，觀察肝再生情況;采用免疫組織化學(xué)技術(shù)（IHC）檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)肝細(xì)胞Ki-67和肝組織Hic-5的表達(dá)情況，分析兩者變化趨勢(shì)之間可能存在的相關(guān)關(guān)系;以免疫熒光技術(shù)(IF)檢測(cè)各時(shí)間

3、點(diǎn)肝組織中Hic-5的表達(dá)量變化及分布;采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)檢測(cè)肝切后不同時(shí)間點(diǎn)Hic-5mRNA及CyclinD1mRNA表達(dá)水平，分析兩者表達(dá)變化之間可能存在的相關(guān)關(guān)系;以免疫印跡技術(shù)(WB)檢測(cè)肝切后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肝臟組織中Hic-5與CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平變化，分析其變化的相關(guān)關(guān)系。以上收集的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）來(lái)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間行單

4、因素方差LSD法分析，相關(guān)關(guān)系用Pearson相關(guān)系數(shù)分析法進(jìn)行分析比較，P＜0.05時(shí)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、各組小鼠均順利完成2/3肝切除術(shù)，術(shù)后存活率100％。ALT、AST均于術(shù)后開(kāi)始升高，其峰值位于12h，且與0h相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并于術(shù)后24 h隨時(shí)間的推移逐漸降低，于術(shù)后168 h恢復(fù)至接近0h水平，與0h相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、HE染色見(jiàn)肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放

5、射狀排列，未見(jiàn)明顯肝細(xì)胞點(diǎn)狀、灶狀壞死，肝細(xì)胞增殖從術(shù)后逐漸增多，在36h處于分裂增殖的肝細(xì)胞明顯增多，且可見(jiàn)大量小核細(xì)胞，后隨時(shí)間的推移，增殖的肝細(xì)胞逐漸減少，再生肝臟肝索結(jié)構(gòu)紊亂。
　　3、肝細(xì)胞Ki-67陽(yáng)性率于0h為（9.58±0.09）％，后隨術(shù)后時(shí)間逐漸升高，于術(shù)后36h達(dá)到高峰（77.13±1.65）％，與0h比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從48 h開(kāi)始逐漸降低，至168 h為（12.29±0.64）％。Hic-5隨時(shí)間

6、點(diǎn)的表達(dá)情況則出現(xiàn)與肝細(xì)胞Ki-67表達(dá)相反的趨勢(shì)，于12 h Hic-5出現(xiàn)表達(dá)高峰，后呈先降低再逐漸升高的趨勢(shì)，表達(dá)的最低點(diǎn)位于36h，其光密度值為（3938.27±82.46），與12h比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從48h開(kāi)始Hic-5的表達(dá)逐漸加強(qiáng)，至168 h升高達(dá)(20075.26±246.64)，高于12h水平，Ki-67和Hic-5的表達(dá)變化趨勢(shì)經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩者表達(dá)趨勢(shì)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　4、

7、Hic-5免疫熒光的變化趨勢(shì)與其免疫組化一致，于12h達(dá)第一個(gè)高峰后呈先降低再升高的趨勢(shì)，最低點(diǎn)位于36h，其熒光強(qiáng)度為（6491.34±162.07），與12h比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，于48 h開(kāi)始逐漸增強(qiáng)，在168 h其熒光強(qiáng)度達(dá)（30824.33±609.44），Hic-5熒光表達(dá)趨勢(shì)與Ki-67的表達(dá)趨勢(shì)經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩者表達(dá)趨勢(shì)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　5、Hic-5mRNA于術(shù)后12h達(dá)高峰，后呈現(xiàn)先

8、降低再逐漸升高的趨勢(shì)，其最低點(diǎn)在術(shù)后36 h為（0.19±0.01），與12h相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，于48 h開(kāi)始逐漸升高，168h達(dá)(1.06±0.03);Cyclin D1mRNA與Hic-5mRNA表達(dá)趨勢(shì)相反，術(shù)后呈逐漸升高至峰值后隨時(shí)間逐漸降低至近0h水平，于術(shù)后36h達(dá)到最高水平為（2.53±0.12），與0h比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者變化趨勢(shì)經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩者表達(dá)趨勢(shì)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　

9、6、Hic-5蛋白表達(dá)與其mRNA變化趨勢(shì)一致，于術(shù)后12h達(dá)第一個(gè)高峰后逐漸下降，在術(shù)后36h達(dá)最低水平，其灰度比值為（0.19±0.09），與12h相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從48 h開(kāi)始逐漸增強(qiáng)，至168 h達(dá)（0.91±0.16），高于術(shù)后12h峰值;CollagenⅠ蛋白表達(dá)12h呈高表達(dá)狀態(tài)，后逐漸降低，于36h達(dá)到最低值為（0.11±0.04），與12h比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后逐漸增高，于168 h達(dá)（0.56±0.0

10、7），兩者蛋白表達(dá)變化經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩者表達(dá)趨勢(shì)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　1、小鼠2/3肝切除后，Hic-5動(dòng)態(tài)變化調(diào)控肝再生過(guò)程，并與肝再生過(guò)程存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，是肝再生過(guò)程中的負(fù)性調(diào)節(jié)基因。
　　2、在肝再生的誘導(dǎo)期，Hic-5通過(guò)表達(dá)下調(diào)促進(jìn)肝再生，而在肝再生的后期，Hic-5通過(guò)表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)細(xì)胞的成熟、分化和抑制細(xì)胞的過(guò)度增殖。
　　3、Hic-5通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞外Colla