Hic-5在小鼠2-3肝切除后的表達變化及其機制研究.pdf

1、目的:
　　1、通過建立C57BL/6小鼠2/3肝切除動物模型，檢測Hic-5在肝再生過程中不同時間點的表達變化。
　　2、研究Hic-5動態(tài)變化與肝細胞再生之間的相關(guān)關(guān)系及可能機制。
　　方法:
　　1、選取40只8-10周齡雄性健康C57BL/6小鼠，體重約20-25g，飼養(yǎng)于SPF動物房中。利用分葉順次肝大部切除技術(shù)建立小鼠2/3肝切除后肝再生動物模型。
　　2、分別于術(shù)后0h、12h、24 h、36

2、h、48 h、72 h、120 h、168 h，8個時間點采集血液和肝組織標(biāo)本，每個時間點5只小鼠。
　　3、血清學(xué)標(biāo)本采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測肝切后不同時間點谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的表達變化情況;各時間點肝臟組織行HE染色，觀察肝再生情況;采用免疫組織化學(xué)技術(shù)（IHC）檢測各時間點肝細胞Ki-67和肝組織Hic-5的表達情況，分析兩者變化趨勢之間可能存在的相關(guān)關(guān)系;以免疫熒光技術(shù)(IF)檢測各時間

3、點肝組織中Hic-5的表達量變化及分布;采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)檢測肝切后不同時間點Hic-5mRNA及CyclinD1mRNA表達水平，分析兩者表達變化之間可能存在的相關(guān)關(guān)系;以免疫印跡技術(shù)(WB)檢測肝切后不同時間點小鼠肝臟組織中Hic-5與CollagenⅠ蛋白表達水平變化，分析其變化的相關(guān)關(guān)系。以上收集的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）來對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)描述，用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，組間行單

4、因素方差LSD法分析，相關(guān)關(guān)系用Pearson相關(guān)系數(shù)分析法進行分析比較，P＜0.05時，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、各組小鼠均順利完成2/3肝切除術(shù)，術(shù)后存活率100％。ALT、AST均于術(shù)后開始升高，其峰值位于12h，且與0h相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，并于術(shù)后24 h隨時間的推移逐漸降低，于術(shù)后168 h恢復(fù)至接近0h水平，與0h相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2、HE染色見肝細胞以中央靜脈為中心呈放

5、射狀排列，未見明顯肝細胞點狀、灶狀壞死，肝細胞增殖從術(shù)后逐漸增多，在36h處于分裂增殖的肝細胞明顯增多，且可見大量小核細胞，后隨時間的推移，增殖的肝細胞逐漸減少，再生肝臟肝索結(jié)構(gòu)紊亂。
　　3、肝細胞Ki-67陽性率于0h為（9.58±0.09）％，后隨術(shù)后時間逐漸升高，于術(shù)后36h達到高峰（77.13±1.65）％，與0h比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，從48 h開始逐漸降低，至168 h為（12.29±0.64）％。Hic-5隨時間

6、點的表達情況則出現(xiàn)與肝細胞Ki-67表達相反的趨勢，于12 h Hic-5出現(xiàn)表達高峰，后呈先降低再逐漸升高的趨勢，表達的最低點位于36h，其光密度值為（3938.27±82.46），與12h比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，從48h開始Hic-5的表達逐漸加強，至168 h升高達(20075.26±246.64)，高于12h水平，Ki-67和Hic-5的表達變化趨勢經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩者表達趨勢呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　4、

7、Hic-5免疫熒光的變化趨勢與其免疫組化一致，于12h達第一個高峰后呈先降低再升高的趨勢，最低點位于36h，其熒光強度為（6491.34±162.07），與12h比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，于48 h開始逐漸增強，在168 h其熒光強度達（30824.33±609.44），Hic-5熒光表達趨勢與Ki-67的表達趨勢經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩者表達趨勢呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　5、Hic-5mRNA于術(shù)后12h達高峰，后呈現(xiàn)先

8、降低再逐漸升高的趨勢，其最低點在術(shù)后36 h為（0.19±0.01），與12h相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，于48 h開始逐漸升高，168h達(1.06±0.03);Cyclin D1mRNA與Hic-5mRNA表達趨勢相反，術(shù)后呈逐漸升高至峰值后隨時間逐漸降低至近0h水平，于術(shù)后36h達到最高水平為（2.53±0.12），與0h比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，兩者變化趨勢經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩者表達趨勢呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　

9、6、Hic-5蛋白表達與其mRNA變化趨勢一致，于術(shù)后12h達第一個高峰后逐漸下降，在術(shù)后36h達最低水平，其灰度比值為（0.19±0.09），與12h相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，從48 h開始逐漸增強，至168 h達（0.91±0.16），高于術(shù)后12h峰值;CollagenⅠ蛋白表達12h呈高表達狀態(tài)，后逐漸降低，于36h達到最低值為（0.11±0.04），與12h比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，后逐漸增高，于168 h達（0.56±0.0

10、7），兩者蛋白表達變化經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩者表達趨勢呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　1、小鼠2/3肝切除后，Hic-5動態(tài)變化調(diào)控肝再生過程，并與肝再生過程存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，是肝再生過程中的負(fù)性調(diào)節(jié)基因。
　　2、在肝再生的誘導(dǎo)期，Hic-5通過表達下調(diào)促進肝再生，而在肝再生的后期，Hic-5通過表達上調(diào)可能促進細胞的成熟、分化和抑制細胞的過度增殖。
　　3、Hic-5通過動態(tài)調(diào)節(jié)細胞外Colla