SP600125對大鼠BMSCs在TNF-α作用下的抗凋亡及軟骨分化能力的影響研究.pdf

1、目的:關(guān)節(jié)軟骨是運(yùn)動系統(tǒng)的重要組成部分，人口老齡化引起的關(guān)節(jié)軟骨磨損、退行性變和各種創(chuàng)傷及運(yùn)動損傷造成的軟骨損傷逐漸增多。關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨，軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix， ECM)是其主要組成部分，其為一種形式特別的結(jié)締組織。關(guān)節(jié)軟骨的功能主要包括兩個方面，一是減輕關(guān)節(jié)運(yùn)動過程中作用于軟骨下骨的壓力，二是減少關(guān)節(jié)面的摩擦。因為軟骨組織的營養(yǎng)只是來源于關(guān)節(jié)液，同時也沒有血液供應(yīng)，所以，在軟骨組織發(fā)生破

2、壞以后，血液或骨髓里的祖細(xì)胞無法被激活進(jìn)入缺損處進(jìn)行修復(fù)，損傷很難自愈。如果沒有得到正確的處理，那么骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生是在所難免的。骨性關(guān)節(jié)炎是一種慢性退行性疾病，主要在髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)等負(fù)重關(guān)節(jié)多發(fā)。它在病理上的改變主要體現(xiàn)在:軟骨的骨化退變、關(guān)節(jié)內(nèi)游離體的形成、繼發(fā)性的軟骨下骨囊性變、關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成、以及骨重塑增多等方面。它以引起關(guān)節(jié)的退行性變及受累關(guān)節(jié)的疼痛為特點(diǎn)，目前還沒有徹底阻止其進(jìn)展的方法。骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展的主要因素為關(guān)節(jié)組織內(nèi)

3、的慢性炎癥以及其漸進(jìn)性的結(jié)構(gòu)改變。TNF-α，作為一個重要的在骨性關(guān)節(jié)炎中高表達(dá)的細(xì)胞因子，它可以通過ERK，p38，JNK，AP-1和NF-κB的轉(zhuǎn)錄增加MMP-13的表達(dá)。傳統(tǒng)的軟骨修復(fù)方法都不能夠逆轉(zhuǎn)骨性關(guān)節(jié)炎的病程進(jìn)展，最終會采取人工關(guān)節(jié)置換的方法來達(dá)到緩解癥狀和恢復(fù)功能的目的。
　　炎癥的分類主要包括細(xì)菌性和無菌性兩大類。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、老化或者雌激素缺乏等病人的血液中，炎癥因子TNF-α的表達(dá)量均有不同程度的升高。有

4、些外來物如細(xì)菌毒素(如LPS)和細(xì)胞碎片等都可以刺激機(jī)體產(chǎn)生很多炎癥細(xì)胞因子（如TNF-α等)，進(jìn)而NF-κB等炎癥反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子被誘導(dǎo)激活，使得機(jī)體發(fā)生一系列的炎癥反應(yīng)。在骨性關(guān)節(jié)炎的過程巾，由滑膜分泌的炎性因子對軟骨細(xì)胞的影響主要體現(xiàn)在對軟骨細(xì)胞基質(zhì)的降解上。有體外研究表明，IL-1β和TNF-α能夠明顯抑制BMSCs的成骨及成軟骨分化作用。除此之外，TNF-α還能直接引起大鼠BMSCs的凋亡。
　　JNK信號通路可以參與

5、機(jī)體的各種生物學(xué)反應(yīng)，主要包括細(xì)胞形態(tài)維持和細(xì)胞骨架構(gòu)建，同時還有細(xì)胞凋亡、細(xì)胞惡變以及細(xì)胞增殖與分化等。其中缺血/再灌注損傷的主要機(jī)制之一就是JNK參與的細(xì)胞凋亡作用。JNK信號通路可被表皮生長因子、細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1)、應(yīng)激及G蛋白偶聯(lián)受體等胞外刺激激活。已有研究表明，IL-1可以通過JNK信號通路誘發(fā)透明軟骨組織中的蛋白多聚糖降解。HebaM等人進(jìn)一步在小鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1兩種細(xì)胞因子都可

6、以激活JNK-2基因進(jìn)而使得軟骨組織中的蛋白多聚糖降解。本研究主要是通過對JNK信號通路的抑制，來改造大鼠的BMSCs，進(jìn)而探究通過此種方法改造后的BMSCs，在炎癥細(xì)胞因子TNF-α的作用下的抗凋亡能力及其向軟骨分化能力是否有所提高。
　　研究方法:1、BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及相關(guān)鑒定:常規(guī)對BMSCs進(jìn)行培養(yǎng)，視細(xì)胞生長情況進(jìn)行胰蛋白酶消化、傳代，鋪板后對細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化，對成脂分化細(xì)胞進(jìn)行油紅染色，對

7、成骨分化細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，對成軟骨分化細(xì)胞進(jìn)行阿利新藍(lán)染色。2、Western blot檢測各組細(xì)胞的p-JNK蛋白表達(dá):經(jīng)SP600125處理后，利用Western blot檢測各組細(xì)胞p-JNK蛋白表達(dá)的情況。3、MTT細(xì)胞活性檢測:將BMSCs接種于96孔培養(yǎng)板中，用不同的藥物處理細(xì)胞后，以MTT法通過OD值反映細(xì)胞活性。4、對凋亡細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察:取對數(shù)增長期的BMSCs鋪于6孔板培養(yǎng)24 h，之后在各孔內(nèi)加入不同藥物反應(yīng)，

8、其中陰性對照組不加藥物，其余各組加入50 ng/ml的TNF-α，在5％ CO2，37℃恒溫箱反應(yīng)24 h，其中實(shí)驗組的細(xì)胞用10μM的SP600125預(yù)先處理1h。之后將6孔板置于倒置顯微鏡下觀察不同處理組之間BMSCs的形態(tài)學(xué)變化。5、TUNEL及DAPI細(xì)胞核染色:利用TUNEL/DAPI對細(xì)胞核染色，熒光顯微鏡下對細(xì)胞核形態(tài)進(jìn)行觀察。從細(xì)胞核形態(tài)及顏色兩方面反映細(xì)胞凋亡情況。正常細(xì)胞核無綠色熒光，呈常規(guī)橢圓狀;凋亡細(xì)胞核會呈現(xiàn)出

9、綠色熒光，同時細(xì)胞核形態(tài)也發(fā)生變化，表現(xiàn)出核固縮成團(tuán)，甚至碎裂溶解。6、通過流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞凋亡進(jìn)行測定:利用AnexinⅤ/PI雙染法檢測處理后細(xì)胞早期及晚期凋亡情況。7、Western blot檢測細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá):利用Western blot檢測處理后，細(xì)胞P53、Bcl-2、Bax、cleaved caspass9、cleavedcaspass3等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。8、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗:處理后的細(xì)胞，用Tra

10、nswell細(xì)胞遷移試驗，對細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行觀察。9、成軟骨分化過程中MTT細(xì)胞活性檢測:取成軟骨分化后1天、7天、14天的細(xì)胞進(jìn)行MTT細(xì)胞活性檢測，通過490 nm處的吸光度值來反映不同時間點(diǎn)的細(xì)胞的活性變化。10、實(shí)時定量PCR對成軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測:細(xì)胞成軟骨分化14天后，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后采用實(shí)時定量PCR的方法對成軟骨相關(guān)基因Agc、Sox9進(jìn)行檢測。11、成軟骨分化后細(xì)胞阿利新藍(lán)染色:于6孔板中

11、對BMSCs進(jìn)行成軟骨分化14天后，PBS洗3次，4％的多聚甲醛固定，PBS洗3次，用阿利新藍(lán)染液染色后，于倒置顯微鏡下觀察不同處理組之間BMSCs的染色情況。12、3D培養(yǎng)法誘導(dǎo)細(xì)胞成軟骨分化:細(xì)胞計數(shù)后置于15 ml離心管中，500×g離心5 min，于5％ CO2，37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞成團(tuán)后，用含有不同藥物的成軟骨分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化。13、軟骨球冰凍切片后阿利新藍(lán)染色:3D培養(yǎng)法誘導(dǎo)不同組的細(xì)胞成軟骨分化后，細(xì)胞固

12、定，OCT包埋，軟骨球進(jìn)行冰凍切片后進(jìn)行阿利新藍(lán)染色，顯微鏡下觀察照相。14、軟骨分化后細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫熒光染色:取固定透化的細(xì)胞標(biāo)本，加入兔抗鼠Ⅱ型膠原抗體（一抗）稀釋液置于4℃冰箱過夜。將標(biāo)本從冰箱中取出，PBS洗3次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG1∶200稀釋，置于37℃溫箱中60分鐘，80％甘油PBS封片，在熒光顯微鏡下觀察。15、Western blot檢測成軟骨分化蛋白的表達(dá):利用Western blot檢測成軟骨分化后

13、，細(xì)胞Agc、Col2a1成軟骨分化相關(guān)蛋白及MMP-1、MMP-3、MMP-13等炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:1、BMSCs體外貼壁生長良好，具有成脂、成骨、成軟骨分化潛能。BMSCs細(xì)胞貼壁生長，呈長棱形，漩渦狀生長，分布均勻。加入特定的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基后出現(xiàn)相應(yīng)的形態(tài)學(xué)變化:成脂分化的細(xì)胞內(nèi)脂滴可以被油紅O染成紅色，成骨分化后產(chǎn)生的鈣結(jié)節(jié)可以被茜素紅染成紅色，成軟骨分化后的細(xì)胞被阿利新藍(lán)染成藍(lán)色。2、SP600125能夠

14、有效抑制TNF-α所引起的p-JNK蛋白高表達(dá)。Western blot檢測所示，相對于陰性對照組TNF-α可以引起p-JNK蛋白的表達(dá)增高，在應(yīng)用了SP600125預(yù)處理后，相對于單獨(dú)應(yīng)用TNF-α處理組，p-JNK蛋白的表達(dá)有所減低。3、SP600125可以增強(qiáng)TNF-α處理后細(xì)胞的活性。相對于單獨(dú)有TNF-α處理組，用SP600125預(yù)處理的細(xì)胞活性有不同程度的增強(qiáng)，其中以濃度為10μM組，效果最為明顯。4、TNF-α處理后細(xì)胞出

15、現(xiàn)了凋亡形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用SP600125后凋亡程度有所減輕。TNF-α處理后部分細(xì)胞固縮，失去原有的纖維樣形態(tài)，變圓，細(xì)胞排列不緊密，貼壁能力下降。在應(yīng)用SP600125后上述形態(tài)細(xì)胞有所減少。5、TUNEL/DAPI細(xì)胞核染色分析細(xì)胞凋亡。TUNEL/DAPI核染色之后于熒光顯微鏡下對細(xì)胞核進(jìn)行觀察。對照組細(xì)胞核呈現(xiàn)為正常一致的橢圓形，均勻的藍(lán)色熒光，無綠色熒光。TNF-α處理組細(xì)胞核呈現(xiàn)為固縮、碎裂、片狀，失去正常核形態(tài)，呈綠色熒光

16、。在用SP600125預(yù)處理細(xì)胞后，細(xì)胞核凋亡情況有了明顯改善。6、AnnexinⅤ/PI雙染法證實(shí)SP600125可以增強(qiáng)BMSCs的抗凋亡能力。TNF-α處理組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，但在應(yīng)用SP600125預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡率有所下降。7、SP600125預(yù)處理后細(xì)胞的凋亡蛋白表達(dá)量相對于單獨(dú)應(yīng)用TNF-α處理組有明顯減低。Western blot結(jié)果顯示，在應(yīng)用TNF-α處理后Clevead-caspase-9和Clevea

17、d-caspase-3蛋白的表達(dá)出現(xiàn)了相應(yīng)的上調(diào);同時Bax表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)，相反，Bcl-2表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)。在應(yīng)用SP600125預(yù)處理后，上述蛋白的變化情況有所減小。8、SP600125可以增強(qiáng)TNF-α處理后BMSCs的遷移能力。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗顯示，與陰性對照組相比，TNF-α處理后的細(xì)胞穿過小室的數(shù)量明顯減少，SP600125預(yù)處理后的細(xì)胞較單獨(dú)用TNF-α處理組穿過小室明顯增多。9、成軟骨分化過程中各組細(xì)胞活

18、性無顯著差異。在成軟骨分化過程中，不同時間點(diǎn)細(xì)胞的活性無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。10、SP600125能提高TNF-α處理后細(xì)胞成軟骨相關(guān)基因Agc、Sox9的表達(dá)。實(shí)施定量PCR結(jié)果顯示，Agc和Sox9兩個成軟骨相關(guān)基因在TNF-α出現(xiàn)的情況下表達(dá)明顯下調(diào)，而SP600125處理后的細(xì)胞，這兩種基因表達(dá)情況較單獨(dú)用TNF-α處理組顯著增高。11、較單獨(dú)用TNF-α處理組相比，SP600125使得細(xì)胞被阿利新藍(lán)染色更明顯。細(xì)胞成軟骨分化后形

19、態(tài)由原來的長梭形變成多角形或圓形，同時貼壁能力下降，可以被阿利新藍(lán)染成藍(lán)色。同單獨(dú)用TNF-α處理組相比，SP600125使得細(xì)胞被阿利新藍(lán)染色更明顯。12、同單獨(dú)用TNF-α處理相比，加入SP600125后細(xì)胞誘導(dǎo)成的軟骨球較大。3D培養(yǎng)法誘導(dǎo)成軟骨分化結(jié)果顯示，加入TNF-α后誘導(dǎo)的細(xì)胞團(tuán)形狀不規(guī)則，體積較陰性對照組小;使用SP600125處理后，細(xì)胞團(tuán)變得更接近球形，同時體積也較獨(dú)用TNF-α處理組大。13、3D培養(yǎng)法細(xì)胞成軟骨分

20、化更完全。軟骨球冰凍切片后阿利新藍(lán)染色結(jié)果顯示，總體的阿利新藍(lán)染色更充分。同單獨(dú)用TNF-α處理組相比，SP600125使得細(xì)胞被阿利新監(jiān)染色更明顯。14、用SP600125預(yù)處理的細(xì)胞Col2a1表達(dá)量較單獨(dú)用TNF-α處理組相比明顯增多。免疫熒光結(jié)果顯示，同陰性對照組相比，用含有TNF-α的培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化后，Col2a1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量明顯減低。同單獨(dú)用TNF-α處理組相比，加用SP600125處理后細(xì)胞的Col2a1表達(dá)量顯著增加

21、。15、較單獨(dú)用TNF-α處理組，SP600125增加了Agc和Col2a1蛋白表達(dá)量，同時降低了MMP-1、MMP-3以及MMP-13的蛋白表達(dá)量。Western blot結(jié)果顯示，TNF-α可以降低Agc和Col2a1兩種成軟骨相關(guān)蛋白的表達(dá)量，應(yīng)用了SP600125后這兩種蛋白的表達(dá)有所回升。此外，TNF-α可以增加MMP-1、 MMP-3以及MMP-13的蛋白表達(dá)量，SP600125的使用使得這些炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)量下降。