SP600125對(duì)腦死亡大鼠心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　心臟移植已成為挽救終末期心臟疾病患者生命的最有效治療手段之一。腦死亡供體幾乎是目前心臟移植的唯一器官來(lái)源。有研究證實(shí):在器官移植以前腦死亡狀態(tài)本身就已經(jīng)導(dǎo)致移植物生理功能損害和形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，這可能與腦死亡時(shí)經(jīng)歷全身血流動(dòng)力紊亂、細(xì)胞凋亡、嚴(yán)重急性應(yīng)激反應(yīng)、炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子大量釋放等一系列病理生理改變有關(guān)。就目前而言，提高供心質(zhì)量是減少心臟移植患者近遠(yuǎn)期并發(fā)癥的重要方法之一。
　　細(xì)胞凋亡(cell apopt

2、osis)也稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)是一個(gè)主動(dòng)的細(xì)胞死亡過(guò)程,是細(xì)胞外界環(huán)境因素與細(xì)胞自身因素綜合作用的結(jié)果;就像細(xì)胞有絲分裂一樣,該過(guò)程的啟動(dòng)和進(jìn)行同樣受到基因的精確調(diào)控;細(xì)胞死亡的發(fā)生正是這些基因產(chǎn)物相互作用的結(jié)果。近年研究顯示細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷后和心臟移植后心肌細(xì)胞死亡的最主要形式，其中線粒體在細(xì)胞凋亡中的作用備受關(guān)注，而如何減輕腦死亡狀態(tài)下供體心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的心肌損傷已成

3、為研究熱點(diǎn)。
　　線粒體凋亡信號(hào)通路是引起細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性信號(hào)通路。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是MAPK家族重要成員之一，活化的JNK信號(hào)通路可作用于線粒體，并引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore, MPTP）的開(kāi)放，線粒體跨膜電位下降，導(dǎo)致細(xì)胞色素-C（Cyt-C）釋放，通過(guò)一系列的反應(yīng)，最終激活細(xì)胞凋亡

4、的關(guān)鍵執(zhí)行者半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（Caspase-3），導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。SP600125是一種常用的高選擇性JNK抑制劑。
　　目的:
　　在本研究中，我們擬以腦死亡 Sprague-Dawley（SD）大鼠為研究對(duì)象，觀察腦死亡狀態(tài)對(duì)SD大鼠心肌細(xì)胞凋亡、Cyt-C、Caspase-3蛋白及其mRNA的表達(dá)水平的影響，探討腦死亡狀態(tài)是否啟動(dòng)大鼠心肌細(xì)胞線粒體凋亡通路進(jìn)而造成心肌細(xì)胞損傷與凋亡發(fā)生。并進(jìn)一步觀察應(yīng)用

5、SP600125對(duì)腦死亡狀態(tài)下大鼠心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其可能分子機(jī)制。
　　方法
　　選擇20只體重為200-250g健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為4組：SHAM組、腦死亡（Brain Death，BD）組、BD+SP600125藥物（SP600125）組、BD+DMSO溶劑(DMSO)組，每組5只。SHAM組：動(dòng)物麻醉后僅給予顱內(nèi)置入Fogarty管，但不誘導(dǎo)腦死亡；BD組:應(yīng)用改進(jìn)的緩慢間斷顱內(nèi)加壓法建立腦死亡模型并維持

6、腦死亡狀態(tài)至6h，但不預(yù)施加藥物;SP600125組:采用與 BD組相同的方法建立腦死亡模型,于誘導(dǎo)腦死亡狀態(tài)前1h腹腔注射SP600125(10mg/kg)，并維持腦死亡狀態(tài)至6h;DMSO組:與SP600125組相同,但改為注射DMSO(10mg/kg)，并維持腦死亡狀態(tài)至6h。用原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）染色比較各組心肌細(xì)胞凋亡，并用Western blot和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）檢測(cè)各組心肌細(xì)胞

7、中Cyt-C與Caspase-3 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　（1）15只SD大鼠均成功建立腦死亡模型，均可維持腦死亡狀態(tài)至6h，且平均動(dòng)脈壓（MAP）≥80mmHg，模型成功率為100％。
　?。?）TUNEL結(jié)果顯示BD組心肌細(xì)胞凋亡率（26.39±4.99）%比SHAM組（1.41±0.35）%顯著增加（p<0.05）；SP600125組（7.63±3.09）%比BD組顯著降低（p<0.05）；DMS

8、O組（26.28±4.92）%與BD組凋亡率接近（p>0.05）。
　?。?）Western blot結(jié)果顯示BD組Cyt-C和Caspase-3表達(dá)（73.67±7.35、145.63±7.21）比SHAM組（18.74±8.77、38.86±8.95）顯著增多（p<0.05）；SP600125組Cyt-C和Caspase-3表達(dá)（20.34±5.69、39.45±5.73）顯著低于BD組（p<0.05）；DMSO組 Cyt-C

9、和 Caspase-3表達(dá)（72.45±6.84、146.56±6.87）與 BD組接近（p>0.05）。
　　（4）Real-time PCR結(jié)果顯示BD組Cyt-C mRNA和Caspase-3 mRNA表達(dá)（2.03±0.08、2.37±0.12）顯著高于SHAM組（1.00±0.00）（p<0.05）；SP600125組Cyt-C mRNA和Caspase-3 mRNA表達(dá)（1.23±0.24、1.21±0.05）顯著低于

10、BD組（p<0.05）； DMSO組Cyt-C mRNA和Caspase-3 mRNA表達(dá)（2.06±0.09、2.38±0.11）與BD組接近（p>0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.采用改良的緩慢間歇顱內(nèi)加壓法建立的大鼠腦死亡模型，具有簡(jiǎn)單且重復(fù)性好、易于標(biāo)準(zhǔn)化、成功率高以及與臨床腦死亡病理生理過(guò)程相似的優(yōu)點(diǎn)，為研究腦死亡對(duì)人體器官的影響，提供一個(gè)穩(wěn)定而可靠的平臺(tái)。
　　2.腦死亡大鼠心肌細(xì)胞中Cyt-C和Caspa