M-CSF對(duì)大鼠BMSCs體外增殖和分化的作用及BMSCs移植對(duì)心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、心肌梗死（myocardial infarction，MI）后機(jī)體存在自然修復(fù)心肌和血管組織的過程，但不足以彌補(bǔ)MI造成的大范圍心肌細(xì)胞缺失，亦不能防止心室重構(gòu)和心功能衰竭的發(fā)生。心血管藥物治療目前雖有很多突破，但這些治療方法都存在著無法逆轉(zhuǎn)梗死期壞死心肌的缺陷，不能從根本上解決心肌細(xì)胞（cardiomyocytes，CMs）減少的問題。近年來發(fā)展的采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell

2、s，BMSCs）代替病變心臟中無收縮功能的瘢痕組織，形成新的心肌細(xì)胞，為治療缺血性心臟病提供了新的方向。骨髓中由于BMSCs數(shù)量很少，必須體外擴(kuò)增才能滿足細(xì)胞移植的需要，而BMSCs增殖能力有限，本研究探討巨噬細(xì)胞集落因子（macrophage colony—stimulating factor，M—CSF）對(duì)大鼠BMSCs的體外增殖和分化的影響及M—CSF擴(kuò)增的BMSCs移植對(duì)心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究。 第一部分 大鼠間充質(zhì)樣干細(xì)胞

3、的分離、培養(yǎng)及其生物學(xué)和電生理特性研究 目的：從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)一步分析其生物學(xué)和電生理特性。 方法：采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)方法分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs，細(xì)胞記數(shù)繪制BMSCs生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs的CD44、CD29、CD45和CD34的表達(dá)及其細(xì)胞周期，5—氮雜胞苷（5—azacytidine，5—aza）誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞，免疫組化檢測(cè)誘導(dǎo)后心肌特異性分子肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac—

4、specific troponinⅠ，cTnⅠ）和肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）的表達(dá)，膜片鉗技術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)前后BMSCs電生理特性。 結(jié)果：培養(yǎng)的BMSCs呈梭形貼壁生長(zhǎng)，可連續(xù)傳代培養(yǎng)；高表達(dá)CD44和CD29，而不表達(dá)CD45和CD34；細(xì)胞在接種后第3d即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，傳代后培養(yǎng)3天的細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示G0+G1、S和G2+M期的比例分別為66.2%、23.8%和10.1%；經(jīng)5—aza誘

5、導(dǎo)3w后的第三代BMSCs細(xì)胞表達(dá)心肌特異性蛋白cTnⅠ和MHC；第三代BMSCs誘導(dǎo)前記錄到快速激活、長(zhǎng)時(shí)開放的外向K+通道電流，未能記錄到內(nèi)向電流，經(jīng)5—aza誘導(dǎo)3w后可記錄到鈉離子和鈣離子通道電流。 結(jié)論：BMSCs具有心肌細(xì)胞分化的潛能，5—aza誘導(dǎo)后BMSCs可由非興奮性細(xì)胞分化為興奮性細(xì)胞。 第二部分 M—CSF對(duì)大鼠BMSCs體外增殖和分化的作用 目的：研究M—CSF對(duì)BMSCs體外增殖的作用，

6、并分析經(jīng)M—CSF擴(kuò)增的BMSCs心肌分化潛能及其電生理特性。 方法：細(xì)胞記數(shù)繪制不同濃度M—CSF對(duì)BMSCs生長(zhǎng)增殖作用的生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)M—CSF擴(kuò)增的BMSCs CD44、CD29、CD45、CD34的表達(dá)及其細(xì)胞周期；5—aza誘導(dǎo)經(jīng)M—CSF擴(kuò)增的BMSCs，細(xì)胞免疫組化檢測(cè)誘導(dǎo)后心肌特異性分子cTnⅠ和MHC的表達(dá)；膜片鉗技術(shù)檢測(cè)M—CSF擴(kuò)增的BMSCs經(jīng)5—aza誘導(dǎo)3w后的心肌樣細(xì)胞膜電流。

7、 結(jié)果：M—CSF濃度達(dá)到5ng/ml時(shí)對(duì)BMSCs有顯著促進(jìn)增殖作用；經(jīng)M—CSF擴(kuò)增BMSCs與自然生長(zhǎng)的BMSCs相比，其CD44、CD29、CD45、CD34的表達(dá)未出現(xiàn)明顯變化，但細(xì)胞周期顯示其增殖能力增強(qiáng)；M—CSF擴(kuò)增后的BMSCs經(jīng)5—aza誘導(dǎo)2w后心肌細(xì)胞特異性蛋白cTnⅠ和MHC均為陽性。M—CSF擴(kuò)增后的BMSCs經(jīng)5—aza誘導(dǎo)3w后，可記錄到鈉離子和鈣離子通道電流。 結(jié)論：M—CSF能促進(jìn)BMSCs體

8、外有效的增殖，而且體外擴(kuò)增的BMSCs具有心肌分化的潛能。 第三部分 M—CSF擴(kuò)增的BMSCs移植對(duì)心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究 目的：模擬心肌環(huán)境及分析心肌環(huán)境對(duì)體外擴(kuò)增的BMSCs分化的影響，同時(shí)建立大鼠心肌梗死（myocardial infarction，MI）模型，在體研究經(jīng)M—CSF擴(kuò)增的BMSCs移植對(duì)心梗后心功能的改善作用及其可能機(jī)制。 方法：經(jīng)M—CSF擴(kuò)增后的BMSCs分別與心肌細(xì)胞和心肌條件培養(yǎng)液共培

9、養(yǎng)1w后免疫組化檢測(cè)cTnⅠ的表達(dá)；制作大鼠心肌梗死模型，心臟超聲檢測(cè)心功能，BrdU標(biāo)記移植細(xì)胞，心肌梗死區(qū)周邊多點(diǎn)注射，BMSCs移植20d后心肌HE染色，病理組織學(xué)檢查梗死區(qū)移植細(xì)胞cTnⅠ表達(dá)和評(píng)價(jià)新生血管密度。 結(jié)果：（1）經(jīng)M—CSF擴(kuò)增的與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)2w后可誘導(dǎo)表達(dá)cTnⅠ，而與心肌條件培養(yǎng)液共培養(yǎng)2w的BMSCs未見cTnⅠ的表達(dá)；（2）C組（MSCs注射組）（SV=0.633±0.045ml，EF=（0.7

10、48±0.054）%）、D組（5—aza誘導(dǎo)BMSCs擴(kuò)增組）（SV=0.641±0.065ml，EF=（0.756±0.058）%）和E組（BMSCs擴(kuò)增組）（SV=0.651±0.062ml，EF=（0.762±0.069）%）與對(duì)照組（SV=0.459±0.052ml，EF=（0.646±0.025）%）相比心功能均明顯改善（P<0.05），而C組、D組和E組間并無明顯差別（P>0.05）；（3）BrdU標(biāo)記顯示M—CSF擴(kuò)增的B

11、MSCs移植體內(nèi)后，可表達(dá)心肌特異性蛋白cTnⅠ；（4）梗死區(qū)新生血管密度M—CSF擴(kuò)增BMSCs組（31±4條/視野）明顯高于對(duì)照組（19±4條/視野）。 結(jié)論：與心肌細(xì)胞的直接接觸性培養(yǎng)可使M—CSF擴(kuò)增的BMSCs分化為心肌細(xì)胞，M—CSF擴(kuò)增的BMSCs移植對(duì)MI后心功能有明顯改善作用；在梗死區(qū)周邊注射M—CSF擴(kuò)增的BMSCs，移植細(xì)胞誘導(dǎo)或不誘導(dǎo)均不影響對(duì)心功能的改善作用。梗死區(qū)周邊注射的M—CSF擴(kuò)增的BMSCs可

12、在梗死區(qū)中分化為心肌樣細(xì)胞；M—CSF擴(kuò)增的BMSCs可提高梗死區(qū)新生血管密度。因此，M—CSF可作為BMSCs有效生長(zhǎng)體外促增殖因子，M—CSF擴(kuò)增的BMSCs具有潛在的臨床運(yùn)用價(jià)值。 綜上所述，BMSCs具有心肌細(xì)胞分化的潛質(zhì)，5—aza誘導(dǎo)后BMSCs可表達(dá)功能性的鈉和鈣離子通道，由非興奮性細(xì)胞分化為興奮性細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)顯示M—CSF是BMSCs的有效生長(zhǎng)體外促增殖因子，而且擴(kuò)增的BMSCs可具有心肌分化潛能。體外模擬心肌