M-CSF對大鼠BMSCs體外增殖和分化的作用及BMSCs移植對心肌梗死的實驗研究.pdf

1、心肌梗死（myocardial infarction，MI）后機體存在自然修復心肌和血管組織的過程，但不足以彌補MI造成的大范圍心肌細胞缺失，亦不能防止心室重構(gòu)和心功能衰竭的發(fā)生。心血管藥物治療目前雖有很多突破，但這些治療方法都存在著無法逆轉(zhuǎn)梗死期壞死心肌的缺陷，不能從根本上解決心肌細胞（cardiomyocytes，CMs）減少的問題。近年來發(fā)展的采用骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell

2、s，BMSCs）代替病變心臟中無收縮功能的瘢痕組織，形成新的心肌細胞，為治療缺血性心臟病提供了新的方向。骨髓中由于BMSCs數(shù)量很少，必須體外擴增才能滿足細胞移植的需要，而BMSCs增殖能力有限，本研究探討巨噬細胞集落因子（macrophage colony—stimulating factor，M—CSF）對大鼠BMSCs的體外增殖和分化的影響及M—CSF擴增的BMSCs移植對心肌梗死的實驗研究。 第一部分 大鼠間充質(zhì)樣干細胞

3、的分離、培養(yǎng)及其生物學和電生理特性研究 目的：從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞并進一步分析其生物學和電生理特性。 方法：采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)方法分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs，細胞記數(shù)繪制BMSCs生長曲線，流式細胞儀檢測BMSCs的CD44、CD29、CD45和CD34的表達及其細胞周期，5—氮雜胞苷（5—azacytidine，5—aza）誘導培養(yǎng)細胞，免疫組化檢測誘導后心肌特異性分子肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac—

4、specific troponinⅠ，cTnⅠ）和肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）的表達，膜片鉗技術(shù)檢測誘導前后BMSCs電生理特性。 結(jié)果：培養(yǎng)的BMSCs呈梭形貼壁生長，可連續(xù)傳代培養(yǎng)；高表達CD44和CD29，而不表達CD45和CD34；細胞在接種后第3d即進入對數(shù)生長期，傳代后培養(yǎng)3天的細胞周期檢測結(jié)果顯示G0+G1、S和G2+M期的比例分別為66.2%、23.8%和10.1%；經(jīng)5—aza誘

5、導3w后的第三代BMSCs細胞表達心肌特異性蛋白cTnⅠ和MHC；第三代BMSCs誘導前記錄到快速激活、長時開放的外向K+通道電流，未能記錄到內(nèi)向電流，經(jīng)5—aza誘導3w后可記錄到鈉離子和鈣離子通道電流。 結(jié)論：BMSCs具有心肌細胞分化的潛能，5—aza誘導后BMSCs可由非興奮性細胞分化為興奮性細胞。 第二部分 M—CSF對大鼠BMSCs體外增殖和分化的作用 目的：研究M—CSF對BMSCs體外增殖的作用，

6、并分析經(jīng)M—CSF擴增的BMSCs心肌分化潛能及其電生理特性。 方法：細胞記數(shù)繪制不同濃度M—CSF對BMSCs生長增殖作用的生長曲線；流式細胞儀檢測經(jīng)M—CSF擴增的BMSCs CD44、CD29、CD45、CD34的表達及其細胞周期；5—aza誘導經(jīng)M—CSF擴增的BMSCs，細胞免疫組化檢測誘導后心肌特異性分子cTnⅠ和MHC的表達；膜片鉗技術(shù)檢測M—CSF擴增的BMSCs經(jīng)5—aza誘導3w后的心肌樣細胞膜電流。

7、 結(jié)果：M—CSF濃度達到5ng/ml時對BMSCs有顯著促進增殖作用；經(jīng)M—CSF擴增BMSCs與自然生長的BMSCs相比，其CD44、CD29、CD45、CD34的表達未出現(xiàn)明顯變化，但細胞周期顯示其增殖能力增強；M—CSF擴增后的BMSCs經(jīng)5—aza誘導2w后心肌細胞特異性蛋白cTnⅠ和MHC均為陽性。M—CSF擴增后的BMSCs經(jīng)5—aza誘導3w后，可記錄到鈉離子和鈣離子通道電流。 結(jié)論：M—CSF能促進BMSCs體

8、外有效的增殖，而且體外擴增的BMSCs具有心肌分化的潛能。 第三部分 M—CSF擴增的BMSCs移植對心肌梗死的實驗研究 目的：模擬心肌環(huán)境及分析心肌環(huán)境對體外擴增的BMSCs分化的影響，同時建立大鼠心肌梗死（myocardial infarction，MI）模型，在體研究經(jīng)M—CSF擴增的BMSCs移植對心梗后心功能的改善作用及其可能機制。 方法：經(jīng)M—CSF擴增后的BMSCs分別與心肌細胞和心肌條件培養(yǎng)液共培

9、養(yǎng)1w后免疫組化檢測cTnⅠ的表達；制作大鼠心肌梗死模型，心臟超聲檢測心功能，BrdU標記移植細胞，心肌梗死區(qū)周邊多點注射，BMSCs移植20d后心肌HE染色，病理組織學檢查梗死區(qū)移植細胞cTnⅠ表達和評價新生血管密度。 結(jié)果：（1）經(jīng)M—CSF擴增的與心肌細胞共培養(yǎng)2w后可誘導表達cTnⅠ，而與心肌條件培養(yǎng)液共培養(yǎng)2w的BMSCs未見cTnⅠ的表達；（2）C組（MSCs注射組）（SV=0.633±0.045ml，EF=（0.7

10、48±0.054）%）、D組（5—aza誘導BMSCs擴增組）（SV=0.641±0.065ml，EF=（0.756±0.058）%）和E組（BMSCs擴增組）（SV=0.651±0.062ml，EF=（0.762±0.069）%）與對照組（SV=0.459±0.052ml，EF=（0.646±0.025）%）相比心功能均明顯改善（P<0.05），而C組、D組和E組間并無明顯差別（P>0.05）；（3）BrdU標記顯示M—CSF擴增的B

11、MSCs移植體內(nèi)后，可表達心肌特異性蛋白cTnⅠ；（4）梗死區(qū)新生血管密度M—CSF擴增BMSCs組（31±4條/視野）明顯高于對照組（19±4條/視野）。 結(jié)論：與心肌細胞的直接接觸性培養(yǎng)可使M—CSF擴增的BMSCs分化為心肌細胞，M—CSF擴增的BMSCs移植對MI后心功能有明顯改善作用；在梗死區(qū)周邊注射M—CSF擴增的BMSCs，移植細胞誘導或不誘導均不影響對心功能的改善作用。梗死區(qū)周邊注射的M—CSF擴增的BMSCs可

12、在梗死區(qū)中分化為心肌樣細胞；M—CSF擴增的BMSCs可提高梗死區(qū)新生血管密度。因此，M—CSF可作為BMSCs有效生長體外促增殖因子，M—CSF擴增的BMSCs具有潛在的臨床運用價值。 綜上所述，BMSCs具有心肌細胞分化的潛質(zhì)，5—aza誘導后BMSCs可表達功能性的鈉和鈣離子通道，由非興奮性細胞分化為興奮性細胞。體外實驗顯示M—CSF是BMSCs的有效生長體外促增殖因子，而且擴增的BMSCs可具有心肌分化潛能。體外模擬心肌