TNF-α對EPCs分化的影響及其在肉雞肺血管叢樣病變形成中的作用.pdf

1、肺血管叢樣病變是重度肺動脈高壓(PAH)病人的特異性病變，該病變主要發(fā)生在肺小動脈分叉處，由內(nèi)皮樣細胞和肌成纖維細胞等多種細胞混合構(gòu)成“腎小球”樣結(jié)構(gòu)阻塞在血管腔內(nèi)，病變血管周圍通常伴有不同程度的炎性細胞浸潤。肉雞對PAH高度易感，并可形成與PAH病人相似的叢樣病變。內(nèi)皮祖細胞(EPCs)是內(nèi)皮細胞的前體細胞，在血管修復機制中發(fā)揮重要作用。本研究旨在揭示EPCs與肉雞叢樣病變形成之間的關(guān)系，并探索炎癥反應在這一過程中的作用。
　　

2、實驗一:EPCs與肺血管叢樣病變的關(guān)系研究。1日齡肉雞常規(guī)飼養(yǎng)至6周齡，每周隨機選取至少6只撲殺，采集心臟，分離右心室和左心室，計算右心/全心比(RV/TV);采集右肺相同部位肺組織，常規(guī)石蠟切片，H·E染色，觀察肺血管叢樣病變的形成情況，并計算叢樣病變密度;采用免疫組化法鑒定EPCs;采用免疫組化法結(jié)合病理圖像分析，檢測每張肺組織切片中與叢樣病變相對應的來源血管中CD133和CD31的表達，并隨機挑選正常血管作為對照。結(jié)果:RV/TV

3、值顯示所有參試肉雞均未形成PAH;在各年齡階段肉雞中均可觀察到叢樣病變;叢樣病變呈動態(tài)發(fā)展，幼稚叢樣病變主要由上皮樣細胞構(gòu)成，成熟病變則由泡沫樣巨噬細胞、肌成纖維細胞和結(jié)締組織基質(zhì)構(gòu)成;肺組織中叢樣病變密度在前3周內(nèi)呈年齡依賴性下降，至第4周齡時顯著升高，此后逐漸下降，提示4周齡肉雞肺組織中有新的叢樣病變形成;免疫組化染色結(jié)果顯示，幼稚叢樣病變中的上皮樣細胞主要為EPCs(CD133+/VEGFR-2+)，但成熟病變中的巨噬細胞亦呈CD

4、133和VEGFR-2強陽性染色，提示病變形成過程中存在EPCs向巨噬細胞分化現(xiàn)象。叢樣病變來源血管內(nèi)皮中CD133表達較正常血管顯著上升(P＜0.001)，但CD31的表達顯著下降(P＜0.001)。上述結(jié)果提示:肺血管叢樣病變的形成與EPCs向內(nèi)皮細胞分化障礙有關(guān)，EPCs向巨噬細胞分化可能是導致其失去血管修復能力并最終促進叢樣病變形成的重要原因。
　　實驗二:腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在肺血管叢樣病變形成中的作用及機制研

5、究。方法:選擇14日齡臨床健康肉雞12只，隨機分為試驗組和對照組。試驗組于氣管內(nèi)滴注100μL濃度為5μg/mL的TNF-α，3d后再采用相同的方法滴注1次，對照組滴注相同劑量生理鹽水。于最后一次給藥3d后撲殺肉雞，采集右肺下1/3部分制作連續(xù)石蠟切片，計數(shù)叢樣病變數(shù)量并計算病變密度;采用免疫組化法鑒定EPCs(CD133+/VEGFR-2+)和巨噬細胞(KUL01+細胞)。分離肉雞外周血單個核細胞，采用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成

6、纖維細胞生長因子(FGF)和胰島素樣生長因子(IGF)聯(lián)合誘導細胞向EPCs分化。培養(yǎng)至第4d時，在培養(yǎng)基中分別加入終濃度為10、50和100ng/mL的重組TNF-α刺激細胞，以正常培養(yǎng)的細胞為對照。分別于刺激后第3、6和9d，采用Dil-ac-LDL/FITC-UEA-1熒光雙染法鑒定EPC表型;采用Boyden小室法檢測細胞遷移能力;采用MTT法檢測細胞增殖能力;采用qPCR法檢測培養(yǎng)物中EPCs標志CD133和VEGFR-2、內(nèi)

7、皮細胞標志CD31和巨噬細胞標志CD44mRNA的表達。結(jié)果顯示，外源性給予TNF-α可顯著促進肺血管叢樣病變形成(P＜0.05);幼稚叢樣病變中的細胞呈CD133、VEGFR-2和KUL01陽性。TNF-α(10-100ng/mL)作用6-9d后，Dil-ac-LDL/FITC-UEA-I雙染陽性細胞百分率較對照組顯著下降，提示EPCs數(shù)量減少;不同濃度TNF-α于不同作用時間點均顯著抑制EPCs增殖和遷移;TNF-α(50ng/mL