髓核細胞中p38亞型的差異性表達及其對椎間盤退變中巨噬細胞的極化作用研究.pdf

1、第一部分:髓核細胞中p38亞型的差異性表達及其在椎間盤退變中的作用及機制研究
　　研究背景:椎間盤(Intervertebral disc，IVD)位于椎體之間，主要由髓核(Nucleuspulposus，NP)和纖維環(huán)(Annulus fibrosus，AF)構(gòu)成，是人體脊柱結(jié)構(gòu)的重要組成部分。其生理功能主要包括參與脊柱屈、伸、旋轉(zhuǎn)等運動功能，維持椎間隙高度，以及承載負荷和分散應(yīng)力等。目前已經(jīng)證實，椎間盤退行性病變(Interv

2、ertebral discdegeneration，IDD)是引起下腰痛(Low back pain，LBP)及成人腰椎間盤突出癥的主要原因之一。近年來，隨著椎間盤內(nèi)炎性介質(zhì)對椎間盤影響的研究快速發(fā)展，炎性反應(yīng)(Inflammation)成為了椎間盤退變的重要研究方向。促炎因子(Pro-inflammatorycytokines)如TNF-α、IL-1、COX-2、IL-6、IL-8，IL-10以及基質(zhì)金屬蛋白酶類(Matrixmeta

3、lloproteinases，MMPs)等均和腰椎間盤退變有關(guān)。而上述相關(guān)產(chǎn)物的基因表達都與絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)息息相關(guān)。
　　絲裂原活化蛋白激酶是一種細胞外刺激經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細胞核反應(yīng)的重要信號通路。P38 MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族中的重要成員，在細胞內(nèi)擔負著將細胞外各種有絲分裂和應(yīng)急信號傳遞至細胞核以及調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達從而介導(dǎo)細胞產(chǎn)生一系列

4、反應(yīng)的重要使命，是細胞內(nèi)主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。在椎間盤退變過程中，髓核細胞中p38 MAPK發(fā)揮了重要作用。椎間盤退變時，促炎因子(Pro-inflammatory cytokines)大量分泌聚集，此時，p38 MAPK介導(dǎo)髓核細胞多種分解代謝酶如ADAMTS-4、ADAMTS-5以及MMPs等表達增高。這些分解代謝酶類表達增強導(dǎo)致collagen-Ⅱ(Col-Ⅱ)、aggrecan等椎間盤細胞外基質(zhì)成分大量降解。此外，p38 MAPK

5、信號通路還參與一系列椎間盤退變的細胞生理病理過程如凋亡、自噬、缺氧、血管翳生成等密切相關(guān)。P38 MAPK家族有四個成員:p38α(MAPK14)、p38β(MAPK11)、p38γ(MAPK12/ERK-6)以及p38δ(MAPK13/SAPK4)。這四種亞型的同源性達60％，但卻由不同的上游激酶—絲裂原活化蛋白激酶激酶-3、-4、-6(MKK-3、MKK-4、MKK-6)—選擇性磷酸化。值得注意的是，盡管p38 MAPK在椎間盤退變

6、過程中發(fā)揮了重要作用，然而有關(guān)p38 MAPK各亞型在參與椎間盤退變中的具體作用機制尚不清楚。本實驗研究首次證實了p38α、p38β、p38δ三種亞型在上游激酶MKK-3的的作用下激活進而在椎間盤退變中發(fā)揮重要作用，其中，p38α、p38β可以增強ADAMTS-4、ADAMTS-5，MMPs-13等細胞外基質(zhì)降解酶類的表達，降低Ⅱ型膠原(Collagen-Ⅱ)、聚蛋白聚糖(Aggrecan)等基質(zhì)大分子從而加劇退變，而p38δ則相反，其

7、抑制ADAMTS-4、ADAMTS-5，MMPs-13等表達同時增強基質(zhì)成分aggrecan的表達而對椎間盤起保護作用。
　　目的:探討p38 MAPK四種亞型各自在退變椎間盤髓核細胞中的表達情況，研究其上游激酶的活化情況，系統(tǒng)探討在椎間盤退變中p38 MAPK各亞型對相關(guān)分解代謝酶類及促炎因子的調(diào)節(jié)作用及機制。
　　方法:采用免疫印跡分析(Western blot analysis)方法分別檢測p38 MAPK四種亞型在退

8、變的椎間盤髓核及纖維環(huán)組織中的表達水平;采用免疫印跡(Westernblot)方法分別檢測退變髓核組織中p38α、p38β、p38γ以及p38δ亞型的表達水平;采用免疫印跡分析方法對分級后的退變椎間盤髓核組織中p38 MAPK各亞型及磷酸化p38 MAPK進行檢測以研究各亞型表達水平與椎間盤退變程度的關(guān)系;利用免疫雙熒光標記法(Double-labeling immunofluorescence stain)同時標記CD24及p38MA

9、PK各亞型，研究各亞型的表達情況;利用免疫雙熒光標記法研究p38 MAPK各亞型在退變髓核細胞中的激活情況，利用拉下實驗(Pull-down)進一步確認p38MAPK各亞型在退變椎間盤髓核細胞中的激活情況;利用免疫印跡方法進一步分別檢測正常及不同退變程度椎間盤組織中p38 MAPK上游激酶MKK-3、MKK-4、MKK-6活化情況;為檢測p38 MAPK各亞型在椎間盤退變炎癥反應(yīng)中的作用，利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別沉默p38α、p38β、p

10、38γ以及p38δ的表達，利用定量核酸擴增檢測系統(tǒng)(Real-time quantitative PCR，q-PCR)和WB法證實沉默效果，隨后利用q-PCR法檢測IL-1β干預(yù)髓核細胞后，p38 MAPK各亞型對椎間盤退變相關(guān)指標ADAMTS-4、ADAMTS-5,MMPs-13,CCL-3,collagen-Ⅱ、aggrecan等mRNA的表達水平的影響。
　　結(jié)果:Western blot analysis顯示，與纖維環(huán)組織

11、相比，p38 MAPK在退變的髓核組織中表達上調(diào);利用Western blot方法可以檢測出退變髓核組織中p38α、p38β、p38δ表達，而p38γ并不表達;不同退變程度的椎間盤髓核組織中p38各亞型及磷酸化p38(p-p38)表達情況檢測結(jié)果顯示，p38α、p38β及p-p38表達同退變嚴重程度呈正相關(guān);利用免疫雙熒光標記檢測發(fā)現(xiàn)高達83％的細胞顯示CD24和p38α雙陽性，78％的陽性細胞CD24和p38β雙陽性，p38δ和CD2

12、4雙陽性的細胞表達率為56％，而p38γ和CD24雙陽性的細胞僅為9％左右;分別對p38各亞型及磷酸化p38進行免疫雙熒光標記，發(fā)現(xiàn)約38％的細胞p38α和磷酸化表現(xiàn)同時陽性，33％的細胞p38β和磷酸化表現(xiàn)同時陽性，而p38δ及p38γ陽性同時磷酸化的細胞僅分別為24％和5％;進一步檢測p38上游激酶活化，發(fā)現(xiàn)僅有MKK-3表達上調(diào)，MKK-4，MKK-6未有明顯變化，MKK-3恰是激活p38α、p38β、p38δ的上游激酶;利用IL

13、-1β干預(yù)人椎間盤細胞24小時后，利用q-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)ADAMTS-4、ADAMTS-5，MMPs-13、CCL-3等的mRNA表達上調(diào)，而collagen-Ⅱ及aggrecan的表達降低，利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別抑制p38α、p38β可顯著降低ADAMTS-4、ADAMTS-5，MMPs-13、CCL-3的表達，但是抑制p38δ卻發(fā)現(xiàn)ADAMTS-4、ADAMTS-5表達明顯增強，此外，q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，抑制p38α、p38β可以

14、恢復(fù)collagen-Ⅱ、aggrecan的mRNA表達，抑制p38δ卻對aggrecan表達起抑制作用。
　　結(jié)論:1.退變的椎間盤髓核組織p38 MAPK表達上調(diào)，其四種亞型中，p38α、p38β、p38δ被激活并起到主導(dǎo)作用，而p38γ表達較弱或不表達;p38α、p38β隨著椎間盤退變程度加重表達增加。2.椎間盤退變時，MKK3是激活p38的上游激酶，其激活的亞型恰為p38α、p38β、p38δ。3.抑制p38α、p38β的

15、表達可降低IL-1β誘導(dǎo)的退變相關(guān)產(chǎn)物如ADAMTS-4、ADAMTS-5，MMPs-13、CCL-3等的表達，同時增強collagen-Ⅱ、aggrecan等細胞外基質(zhì)的表達水平，說明p38α、p38β促進退變發(fā)生;而p38δ則相反，抑制p38δ表達后，IL-1β誘導(dǎo)的促進退變相關(guān)因素如ADAMTS-4、ADAMTS-5，MMPs-13等的表達增強，而細胞外基質(zhì)成分aggrecan的表達被明顯抑制，說明椎間盤退變過程中p38δ可能在一

16、定程度上對椎間盤起保護作用。
　　第二部分:椎間盤退變中髓核細胞p38亞型的差異性表達對巨噬細極化用研究
　　研究背景:下腰痛(Low back pain，LBP)是一類最常見的臨床病癥。據(jù)不完全統(tǒng)計，在美國約有80％的成年人曾有過下腰痛的經(jīng)歷，而目前每年僅用于其治療和康復(fù)的費用達數(shù)百億美元之多。我國的下腰痛發(fā)病率與美國無明顯差異，而患者數(shù)量估計為美國的4-5倍。目前已經(jīng)證實，椎間盤退變(Intervertebral dis

17、c degeneration，IDD)是引起下腰痛的主要原因之一。盡管目前關(guān)于椎間盤退變的確切發(fā)病機制尚未完全清楚，但普遍觀點認為以年齡、機械應(yīng)力、炎性反應(yīng)、創(chuàng)傷、內(nèi)分泌以及營養(yǎng)狀態(tài)為主的多重因素在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。目前公認在椎間盤退變過程中，p38 MAPK發(fā)揮了重要作用。椎間盤退變時，促炎因子(Pro-inflammatorycytokines)大量分泌聚集激活髓核細胞中的p38 MAPK，介導(dǎo)分泌更多促炎因子，從而加劇

18、椎間盤的炎性反應(yīng)，同時，p38 MAPK介導(dǎo)髓核(Nucleus pulposus，NP)細胞產(chǎn)生多種分解代謝酶如ADAMTS-4、ADAMTS-5以及MMPs等大量降解細胞外基質(zhì)，同時p38 MAPK的激活還抑制了基質(zhì)主要成分如collagenⅡ、aggrecan等的表達進一步加重退變。此外，p38 MAPK信號通路還參與一系列椎間盤退變的細胞生理病理過程如凋亡、自噬等。
　　研究表明，巨噬細胞在如骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarth

19、ritis，OA)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）等多種炎性疾病中發(fā)揮了重要作用，我們的前期工作表明，退變的椎間盤髓核組織中，巨噬細胞可能是唯一浸潤的炎癥細胞，但其在椎間盤退行性病變中的作用及機制尚不清楚。值得注意的是，有研究表明，在促炎因子刺激下，髓核細胞可以通過p38 MAPK介導(dǎo)趨化因子配體3(CCL3)誘導(dǎo)巨噬細胞的遷移。當巨噬細胞遷移至受傷組織后，會由于微環(huán)境的影響，巨噬細胞可被誘導(dǎo)極化分為兩

20、型:M1型及M2型，M1型巨噬細胞起清除外源物及受損細胞的作用，M2型則促增殖起修復(fù)作用。M1型巨噬細胞特異性表達一氧化氮合酶(iNOS)和CD86，產(chǎn)生大量炎性因子如腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-12(IL-12); Arginase-1與CD206為M2型巨噬細胞表面標志物，M2型巨噬細胞主要分泌IL-10及CCL18等免疫調(diào)節(jié)因子。目前，椎間盤退變中巨噬細胞極化情況尚未有報道。值得一提的是，一

21、系列由p38 MAPK介導(dǎo)椎間盤髓核細胞表達的細胞因子如干擾素γ(IFNγ)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)都可以誘使巨噬細胞極化。因而，進一步深入探討p38 MAPK與巨噬細胞在椎間盤退變中的具體作用機理并闡明巨噬細胞在椎間盤退變中的作用，可以為下一步制定能延緩乃至阻止椎間盤退變的分子生物學(xué)治療方案提供理論依據(jù)。
　　目

22、的:研究炎癥細胞在退變的椎間盤髓核組織中的浸潤情況，探討巨噬細胞與椎間盤退變的關(guān)系及作用機理，明確p38 MAPK與巨噬細胞在椎間盤退變中的具體作用機制，進而為針對椎間盤退變的分子生物學(xué)治療提供一定的理論支撐。
　　方法:利用免疫雙熒光標記檢測法(Double-labeling immunofluorescence stain)檢測退變髓核組織中炎癥細胞浸潤情況，利用CD20、CD45RO、CD4、CD8等特異性標志物檢測淋巴細胞

23、表達情況;利用CD1a、S100檢測樹突狀細胞浸潤情況;為進一步明確炎癥細胞類型，利用CD45、CD68及CD11b等巨噬細胞表面標記物和CD24(髓核細胞表面標志物)再次進行免疫雙熒光檢測，因結(jié)果提示在髓核組織樣本中，僅有CD11b可作巨噬細胞特異性標志物，再次利用CD24和CD11b進行標記證實巨噬細胞是唯一浸潤退變椎間盤髓核組織中的炎癥細胞。利用免疫雙熒光標記法對CD11b陽性的細胞與p38 MAPK各亞型分別表達情況進行研究;利

24、用免疫雙熒光標記法檢測CD11b陽性的細胞分別表達M1型巨噬細胞表面標志物iNOS或CD86，M2型巨噬細胞表面標志物Arginase-1及CD206的情況，明確巨噬細胞極化類型;為測定髓核細胞對巨噬細胞極化作用的影響，將RAW264.7巨噬細胞與不同退變程度椎間盤組織中的髓核細胞及正常髓核細胞分別共培養(yǎng)3天，利用WB法分別檢測iNOS表達情況;為進一步研究髓核細胞中p38 MAPK各亞型對巨噬細胞極化的作用，利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別抑制

25、退變髓核細胞中p38α、p38β、p38γ以及p38δ，三天后與巨噬細胞共培養(yǎng)，對比iNOS及Arginase-1的表達情況;為明確髓核細胞中誘導(dǎo)巨噬細胞極化的細胞因子產(chǎn)物，利用微量樣本多指標流式蛋白定量(Flow cytometric bead array)技術(shù)對共培養(yǎng)液中可能與M1型巨噬細胞極化相關(guān)的細胞因子進行檢測，發(fā)現(xiàn)p38α介導(dǎo)表達的IFNγ，p38α、p38β及p38δ介導(dǎo)表達的GM-CSF可能是退變髓核細胞促進巨噬細胞向M

26、1型極化的關(guān)鍵因素;為進一步證實，將原代髓核細胞培養(yǎng)2天后，分別加入抗IFNγ抗體及抗GM-CSF抗體，24小時后與巨噬細胞共培養(yǎng)，明確其各自對巨噬細胞極化作用的影響。
　　結(jié)果:利用免疫熒光標記檢測(Double-labeling immunofluorescence stain)法結(jié)果顯示，在退變的椎間盤髓核組織中未發(fā)現(xiàn)有淋巴細胞及樹突狀細胞的浸潤，約70％的樣本中可以檢測到CD11b陽性細胞的表達，提示為巨噬細胞，而所有的正

27、常髓核組織中CD11b均為陰性結(jié)果。利用CD45、CD68及CD11b等巨噬細胞表面標記物和CD24(髓核細胞表面標志物)進行免疫雙熒光檢測后發(fā)現(xiàn)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級退變樣本中表現(xiàn)CD45、CD68雙陽性的髓核細胞分別為5％、88％、91％、84％;CD24和CD68雙陽性細胞在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級退變樣本中的比率分別為80％、86％和91％，提示CD68并非巨噬細胞特異性表面標記物，在髓核細胞中只有CD11b可作為巨噬細胞表面標志物，為更明確區(qū)

28、別開髓核細胞與巨噬細胞，利用CD24和CD11b進行標記，無細胞同時表現(xiàn)CD24和CD11b陽性，證實巨噬細胞是退變髓核組織中唯一浸潤的炎癥細胞。利用免疫雙熒光標記法檢測退變的髓核組織，83％的細胞同時表達CD24和p38α，78％的細胞同時表達CD24和p38β，而CD24和p38β同時陽性的細胞約56％，p38γ與CD24同時陽性的細胞僅占9％，幾乎所有CD11b陽性的細胞（約占細胞總數(shù)的20％）均同時顯示p38α、p38β、p38

29、δ陽性。利用免疫雙熒光標記法發(fā)現(xiàn)CD11b陽性的細胞都同時表達M1型巨噬細胞的標記物iNOS或CD86的細胞率分別為84％和80％，而表達M2型的表面標志物Arginase-1及CD206的比率分別為5％和7％，提示椎間盤退變時巨噬細胞向M1型極化;為測定椎間盤細胞與巨噬細胞極化的影響，將RAW264.7巨噬細胞分別與不同程度退變的髓核細胞或正常髓核細胞共培養(yǎng)3天，利用Western blot analysis法測得退變髓核細胞組iNO

30、S表達明顯增強;為進一步研究髓核細胞中p38各亞型在巨噬細胞極化中的作用，利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別抑制退變髓核細胞中p38α、p38β、p38γ以及p38δ，三天后將其培養(yǎng)液與巨噬細胞共培養(yǎng)，與對照組相比，sh-p38α組iNOS表達被完全抑制，sh-p38β、p38δ組被不完全抑制，抑制p38γ的表達對巨噬細胞的極化未見影響，同時未檢測到Arginase-1的表達。利用微量樣本多指標流式蛋白定量技術(shù)對共培養(yǎng)液中可能與M1型極化相關(guān)的細胞

31、因子進行檢測，結(jié)果顯示分別抑制p38α、p38β、p38γ以及p38δ對TNF-α、IL-1β及MCP-1表達無明顯影響，單獨抑制p38α可顯著抑制 IFNγ的表達，單獨抑制p38α、p38β、p38δ可顯著抑制GM-CSF的表達;將原代髓核細胞培養(yǎng)2天后，分別加入抗IFNγ抗體及抗GM-CSF抗體，24小時后與巨噬細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)抑制IFNγ可以部分抑制iNOS的表達，而抑制GM-CSF可完全抑制iNOS的表達。
　　結(jié)論:1.