SIRT1調(diào)控自噬對(duì)人椎間盤髓核細(xì)胞退變的影響.pdf

1、第一部分人椎間盤髓核組織分離、鑒定及髓核細(xì)胞培養(yǎng)
　　目的：掌握人椎間盤髓核細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
　　方法：采用 CollagenⅡ免疫組化、透射電鏡觀察鑒定從青壯年腰椎爆裂骨折及中老年脊柱退行性疾病手術(shù)中取得的椎間盤標(biāo)本經(jīng)分離后的髓核組織；應(yīng)用0.25％胰酶、2%Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化從中老年椎間盤突出癥/腰椎滑脫癥手術(shù)中取得的椎間盤經(jīng)分離后的髓核組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，光鏡觀察、CollagenⅡ免疫細(xì)胞化學(xué)

2、鑒定髓核細(xì)胞。
　　結(jié)果：CollagenⅡ免疫組化、透射電鏡觀察證實(shí)從青壯年腰椎爆裂骨折及中老年脊柱退行性疾病手術(shù)中取得的椎間盤標(biāo)本經(jīng)分離后的部分為髓核組織；成功培養(yǎng)出人退變椎間盤髓核細(xì)胞，形態(tài)學(xué)觀察及CollagenⅡ免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定證實(shí)培養(yǎng)的為髓核細(xì)胞。
　　結(jié)論：成功分離鑒定人椎間盤髓核組織；0.25%胰酶、2%Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法成功培養(yǎng)出原代人椎間盤退變髓核細(xì)胞，并行傳代培養(yǎng)，光鏡下形態(tài)學(xué)觀察、CollagenⅡ

3、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為髓核細(xì)胞。
　　第二部分自噬活性在人正常椎間盤髓核細(xì)胞及退變髓核細(xì)胞中的表達(dá)及意義
　　目的：明確人正常椎間盤髓核細(xì)胞及退變髓核細(xì)胞中自噬活性的差異，SIRT1表達(dá)差異以及不同髓核細(xì)胞凋亡情況。
　　方法：電鏡觀察不同髓核細(xì)胞中自噬體的數(shù)量；熒光定量PCR、Western Blot方法檢測(cè)不同髓核標(biāo)本中SIRT1、LC3、Beclin-1的基因及蛋白表達(dá)差異；免疫組化檢測(cè)不同髓核標(biāo)本中SI

4、RT1、CollagenⅡ、Caspase3的蛋白表達(dá)差異；TUNEL法檢測(cè)不同髓核標(biāo)本中凋亡率差異。
　　結(jié)果：退變髓核細(xì)胞中自噬體數(shù)量，SIRT1、LC3、Beclin-1的基因表達(dá)，SIRT1、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、CollagenⅡ的蛋白表達(dá)均較正常髓核細(xì)胞明顯降低（P＜0.05）；退變髓核細(xì)胞Caspase3蛋白表達(dá)及凋亡率較正常髓核細(xì)胞明顯升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)證實(shí)人退變髓核細(xì)胞中SI

5、RT1低表達(dá)、自噬活性降低、細(xì)胞凋亡率增高；SIRT1與髓核細(xì)胞自噬活性呈正向關(guān)系，與細(xì)胞凋亡呈反向關(guān)系，髓核細(xì)胞自噬活性與凋亡呈反向關(guān)系。
　　第三部分 SIRT1調(diào)控自噬對(duì)人退變髓核細(xì)胞凋亡的影響及分子機(jī)制研究
　　目的：探討SIRT1是否能夠通過調(diào)節(jié)人退變髓核細(xì)胞的自噬從而調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡及可能的分子機(jī)制。
　　方法：首先用 SIRT1激動(dòng)劑 resveratrol、抑制劑 nicotinamide、SIRT1-

6、siRNA處理退變髓核細(xì)胞后用Western Blot法檢測(cè)SIRT1、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的表達(dá)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率變化。然后resveratrol處理髓核細(xì)胞后用自噬抑制劑bafilomycin A抑制自噬，Western Blot法檢測(cè)LC3Ⅱ/Ⅰ、cleaved caspase3的表達(dá)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率變化。最后分別用PI3K抑制劑LY294002和MEK抑制劑PD98059處理髓核細(xì)胞后，Western B

7、lot法檢測(cè)Akt及Erk1/2信號(hào)通路相關(guān)蛋白激活表達(dá)情況。
　　結(jié)果：SIRT1激動(dòng)劑 resveratrol處理細(xì)胞后能提高 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的表達(dá)，同時(shí)降低髓核細(xì)胞凋亡率（P＜0.05）。SIRT1抑制劑nicotinamide、SIRT1-siRNA處理退變髓核細(xì)胞后降低 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的表達(dá)，同時(shí)髓核細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）。bafilomycin A能夠提高LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)（P＜0

8、.05），使凋亡率增加（P＜0.05），同時(shí)能抵消resveratrol降低髓核細(xì)胞凋亡率的作用。Western Blot結(jié)果顯示LY294002能夠通過抑制 Akt磷酸化從而抑制 LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)（P＜0.05），但resveratrol能部分抵消LY294002對(duì)LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)的抑制作用；PD98059能夠通過抑制Erk1/2的磷酸化部分降低LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)，而resveratrol不能逆轉(zhuǎn)PD98059抑制LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)的作用