骨碎補(bǔ)總黃酮的富集工藝及其對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12損傷細(xì)胞保護(hù)作用研究.pdf

1、阿爾茨海默癥是認(rèn)知、調(diào)控能力逐漸改變的一種神經(jīng)性疾病，目前尚未有有效的醫(yī)學(xué)治療手段，治愈阿爾茨海默病已成為全世界攻克的難題。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，阿爾茨海默癥的病因由多種因素引起，多為腎氣虛衰，致髓海不足，腦髓空虛而使腦組織萎縮、功能減退而致呆癡，故補(bǔ)腎益精填髓是治療之根本。骨碎補(bǔ)(Drynaria fortunei)是傳統(tǒng)補(bǔ)腎良方，臨床上常用于治療老年記憶衰退。現(xiàn)代藥理學(xué)表明，骨碎補(bǔ)中黃酮類化合物是改善記憶功能的主要活性成分，故本實(shí)驗(yàn)篩選優(yōu)化

2、了骨碎補(bǔ)總黃酮的富集工藝，并考察了骨碎補(bǔ)總黃酮對Aβ25-35誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　首先，建立骨碎補(bǔ)總黃酮的紫外定量分析方法，以柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品為對照品，考察精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率，用于評價和優(yōu)化骨碎補(bǔ)總黃酮的富集工藝。
　　其次，分別考察50％、55％、60％、70％、80％乙醇對總黃酮的提取效果，確定55％乙醇為最佳提取溶劑。考慮到工業(yè)化生產(chǎn)可行性，最終選擇乙醇加熱回流作為總黃酮的提取方法。采用L9

3、(34)正交試驗(yàn)法對乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數(shù)四因素進(jìn)一步的綜合考察，從而確定骨碎補(bǔ)總黃酮的最佳提取工藝:55％乙醇為提取溶劑，14倍體積的生藥量，加熱回流提取3次，每次1.5h。
　　通過考察樹脂吸附性、解吸性等性能，最終確定AB-8型樹脂為最佳大孔樹脂。以單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)法，優(yōu)化出骨碎補(bǔ)總黃酮的最佳富集工藝:AB-8型大孔樹脂20g，徑高比1∶5，吸附10mL(20mg.L-1)的總黃酮水溶液(pH=4.0，2

4、0℃)24h，分別用8BV的水和50％8BV的乙醇以1.0mL/min流速進(jìn)行洗脫，收集合并50％乙醇洗脫液，經(jīng)減壓濃縮后得骨碎補(bǔ)富集物。富集物中骨碎補(bǔ)總黃酮的含量為76.11％，總黃酮轉(zhuǎn)移率78.82％，柚皮苷含量為20.41％，柚皮苷轉(zhuǎn)移率為76.53％。
　　最后，將Aβ25-35誘導(dǎo)后的PC12細(xì)胞做為阿爾茨海默癥體外細(xì)胞模型，并將純化后不同濃度的骨碎補(bǔ)總黃酮作用于細(xì)胞模型上。利用MTT法檢測出最佳藥物作用濃度，2×10-

5、7g/mL骨碎補(bǔ)純化物對Aβ25-35誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞保護(hù)作用最強(qiáng)，在該濃度下作用于Aβ25-35誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞，檢測細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)得出在濃度為2×10-7g/mL的給藥組中細(xì)胞的增殖率顯著升高(P＜0.01)，其細(xì)胞增殖率達(dá)到93％。說明純化后的骨碎補(bǔ)總黃酮對損傷后的PC12細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。
　　本實(shí)驗(yàn)建立了骨碎補(bǔ)總黃酮定量分析方法，通過方法學(xué)考察證明其準(zhǔn)確性、重復(fù)性及穩(wěn)定性良好，可用于骨碎補(bǔ)中總黃酮的含