乙肝病毒X基因?qū)epG2細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的: 探討HBX基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞HepG2凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。 方法: 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將HBX基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-X轉(zhuǎn)入人肝癌細(xì)胞HepG2中，建立瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型(HepG2/HBXT)；G418篩選陽(yáng)性克隆，反復(fù)傳代，并且至少凍存1次，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型(HepG2/HBXs)。通過(guò)RT-PCR、免疫熒光和免疫印跡檢測(cè)鑒定HBX基因在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)。以轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的H

2、epG2(HepG2/pcDNA3.1)細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞為對(duì)照，取瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h、96h細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，作以下處理：行流式細(xì)胞術(shù)分析肝細(xì)胞凋亡率的變化；分別取細(xì)胞標(biāo)本抽提RNA并以β-actin為內(nèi)參，半定量RT-PCR法檢測(cè)HBX mRNA和凋亡相關(guān)基因Fas mRNA、BaxmRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)量的變化。 結(jié)果: (1)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染均成功地將HBX基因轉(zhuǎn)至HepG2細(xì)胞中

3、，經(jīng)RT-PCR、免疫熒光和免疫印跡法證實(shí)了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中均有HBX基因的表達(dá)。(2)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后于24h、48h、72h、96h，HepG2/HBXT與HepG2/pcDNA3.1T細(xì)胞相比，細(xì)胞凋亡率、Fas mRNA表達(dá)量、Bax mRNA表達(dá)量均增高，而B(niǎo)cl-2 mRNA表達(dá)量均減少，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HepG2/HBXT與HepG2細(xì)胞相比，細(xì)胞凋亡率、Fas mRNA表達(dá)量、Bax mRNA 表達(dá)

4、量均增高，而B(niǎo)cl-2 mRNA表達(dá)量均減少，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HepG2/pcDNA3.1T與HepG2細(xì)胞相比，細(xì)胞凋亡率、Fas mRNA表達(dá)量、Bax mRNA表達(dá)量及Bcl-2 mRNA表達(dá)量差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(3)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)HepG2/HBXT細(xì)胞HBX mRNA表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高(P<0.05)，其細(xì)胞凋亡率、Fas mRNA表達(dá)量、Bax mRNA表達(dá)量也均逐漸增高(P<0.0

5、5)，且HBX mRNA表達(dá)量與細(xì)胞凋亡率、Fas mRNA表達(dá)量、Bax mRNA表達(dá)量均呈正相關(guān)(P<0.05)；Bcl-2 mRNA表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少(P<0.05)，且HBXmRNA表達(dá)量與Bcl-2 mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。(4)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)，HepG2/HBXs與HepG2/pcDNA3.1s及HepG2細(xì)胞兩兩相比，細(xì)胞凋亡率、FasmRNA表達(dá)量、Bax mRNA表達(dá)量差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05

6、)；而HepG2/HBXs細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)量較HepG2/pcDNA3.1s及HepG2細(xì)胞均增高，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HepG2/pcDNA3.1s與HepG2細(xì)胞相比，Bel-2 mRNA表達(dá)量差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論: (1)本實(shí)驗(yàn)成功建立了瞬時(shí)及穩(wěn)定表達(dá)HBX的HepG2/HBX細(xì)胞模型。(2)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)HBX基因可通過(guò)上調(diào)Fas、Bax，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)HepG2