絲素蛋白作為促血管生長基因載體的研究.pdf

1、血管的再生是組織工程及原位組織再生領域面臨的關鍵問題。利用轉基因技術，將促進血管再生的生長因子基因導入目的細胞并使其表達，可有效促進血管生成。VEGF165和Ang-1是兩種最重要的促血管再生生長因子。VEGF作用于血管形成的早期，促進原始血管網(wǎng)的形成，Ang-1則作用于其后的血管改建、塑形，促進形成成熟的且具有空間結構的血管網(wǎng)。聯(lián)合使用VEGF165和Ang-1雙基因轉染細胞，則既有利于相互協(xié)調共同促進血管的形成，又可使新生血管獲得持

2、久穩(wěn)定的結構。為了將目的基因導入靶細胞，需要依靠基因傳遞載體。分子量為25kDa的支鏈PEI是迄今最成功的非病毒高分子基因載體，其表面帶有高密度的正電荷，轉染效率較高，但細胞毒性較大。絲素蛋白是一種具有良好細胞相容性和可降解性的蛋白質，絲素分子帶負電，不能直接包裝DNA，但是能夠屏蔽PEI多余的正電荷，減小細胞毒性。同時柞蠶絲素蛋白內存在細胞特異性粘附序列RGD，可以與血管內皮細胞、成纖維細胞等細胞表面的受體發(fā)生特異性相互作用。因此，用

3、絲素和PEI共同包裝質粒DNA，作為基因傳遞載體，可以通過細胞表面受體介導的特異性相互作用及其內吞作用，代替PEI和細胞的非特異性靜電相互作用，以降低細胞毒性，提高轉染效率。
　　 本文以絲素和PEI共同作為VEGF165和Ang-1雙基因共表達質粒的傳遞載體，研究與PEI單獨作為傳遞載體相比，載體的形態(tài)、結構、理化性質的變化，及其對細胞毒性、轉染效率的影響，并對其影響機制進行初步探討。
　　 首先，通過靜電吸附方法制備

4、PEI/DNA復合物，DNA的含量為2μg/ml。用瓊脂糖凝膠電泳確定能完全包被質粒時，PEI與DNA的N/P比大于3。MTT法證明，細胞培養(yǎng)液中PEI含量在1-5μg/ml時，細胞存活率都在90％以上，細胞毒性較低。PEI含量為3μg/ml時(其中，PEI/DNA復合物的含量為5μg/ml，DNA的含量為2μg/ml)，熒光強度最強，轉染效率最大，且細胞毒性較低。
　　 其次，分別用柞蠶絲素(Antheraeapernyisi

5、lkfibroin，ASF)和家蠶絲素(Bombyxmorisilkfibroin，BSF)包被PEI/DNA，得到ASF/PEI/DNA和BSF/PEI/DNA復合物。用X-射線能譜分析了復合物表面元素的含量變化，證明蠶絲絲素可以結合到PEI/DNA表面。原子力顯微鏡(AFM)和激光粒度儀(DLS)測試結果顯示ASF和BSF都可以包被PEI/DNA形成納米級顆粒，PEI/DNA的平均粒徑為274.3±3.4nm，ASF/PEI/DNA

6、的平均粒徑是337.6±7.4nm，SF/PEI/DNA復合物的粒徑與PEI/DNA相比有所增大。ASF/PEI/DNA和BSF/PEI/DNA的表面電位與PEI/DNA相比有明顯降低。SF/PEI/DNA三元復合物能抵抗核酸酶的降解。
　　 最后，分別用ASF/PEI/DNA和BSF/PEI/DNA轉染L929細胞，激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察轉染情況，流式細胞儀檢測綠色熒光蛋白(GFP)陽性細胞比率。結果表明，ASF/P

7、EI/DNA復合物的轉染效率比PEI/DNA復合物的高。轉染CHL細胞后，出現(xiàn)了相似的結果。MTT法測試結果顯示ASF/PEI/DNA組的細胞存活率大于PEI/DNA組的細胞存活率。用ASF與PEI共包被DNA后，一方面能夠通過受體介導的內吞作用，增強復合物對細胞的靶向性：另一方面能降低復合物的細胞毒性，使細胞生長狀況和功能良好，有利于轉錄和翻譯，從而提高VEGF-Ang-1雙基因共表達質粒的基因轉染效率。細胞經(jīng)轉染攜帶雙基因片段的質粒

8、后，VEGF的分泌比同種條件下的攜帶單基因的質粒組分泌的VEGF多。同一時間點，ASF/PEI/DNA組細胞比其它組細胞分泌的VEGF多。證明用ASF與PEI共同包被DNA，不僅能夠提高轉染效率，而且轉染后的VEGF基因能夠正常表達、分泌VEGF。
　　 本文首次用柞蠶絲素蛋白和PEI共同作為VEGF165和Ang-1雙基因共表達傳遞載體轉染成纖維細胞，研究表明，與單純使用PEI相比，能有效提高轉染效率并降低細胞毒性，為組織工程