三株含有人FGF-2、VEGF165、VEGF121基因非復制型腺病毒的構(gòu)建和鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的構(gòu)建三株含有hFGF2、hVEGF165、hVEGF121基因的非復制型重組腺病毒,以期用于皮瓣血運障礙的基因治療.方法以AdEasy系統(tǒng)為基礎(chǔ),利用原核細胞的同源重組機制構(gòu)建非復制型重組腺病毒.首先設(shè)計引物,通過RT-PCR從Hep-2細胞(喉鱗癌細胞)的總mRNA中擴增得到三個目的基因的cDNA.分別將其重組到克隆載體pGEM-T Easy中,經(jīng)測序證實后,進一步重組到穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV上,獲得分別含有三種不同目的

2、基因的重組穿梭質(zhì)粒.用Pme I酶切線性化重組穿梭質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的E.coli BJ5183/p的感受態(tài)細胞,完成同源重組.取陽性克隆、小提質(zhì)粒.再分別轉(zhuǎn)化E.coliDH10B感受態(tài)細胞,獲得可產(chǎn)生高拷貝質(zhì)粒的E.coli DH10B菌株.采用限制性內(nèi)切酶分析、測序等方法對三種重組腺病毒質(zhì)粒進行鑒定.最后將重組腺病毒質(zhì)粒用Pac I酶切,獲得重組腺病毒DNA分子,用脂質(zhì)體法,轉(zhuǎn)染293包裝細胞,得到三

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