p38MAPK信號轉導通路在EGF誘導食管腺癌SEG-1細胞表達u-PA中的作用.pdf

1、近年來，由Barrett食管（Barrett's esophagus，BE）轉化而來的食管腺癌的發(fā)病率明顯升高，成為所有惡性腫瘤中增長速度最快的一種。食管腺癌是一種惡性度較高的消化道腫瘤，其侵襲力和轉移率較高，許多患者在就診時已處于腫瘤晚期，5年生存率很低。目前與食管腺癌侵襲轉移有關的因子成為當前研究重點之一。
　　 表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）通過其細胞表面的受體（epidermal

2、growth factor receptor，EGFR）即表皮生長因子受體介導發(fā)揮多種生物學效應。有研究表明：EGF與受體結合后，通過激發(fā)多條信號傳導通路，將有絲分裂信號傳遞到細胞核，引起細胞增殖，同時在細胞的侵襲、轉移中起重要作用。另有研究發(fā)現(xiàn)EGF及其受體EGFR在食管腺癌組織中表達明顯增高，并與腫瘤的發(fā)展和預后密切相關。提示EGF可能在刺激食管腺管癌細胞侵襲，促進腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。
　　 腫瘤侵襲是一個多階段過程

3、，包括細胞增殖、黏附、運動及各種酶的分泌。在這些環(huán)節(jié)中，細胞外基質(zhì)和細胞基底膜的降解是腫瘤侵襲過程中的關鍵所在。研究證實，尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，u-PA）作用系統(tǒng)被認為在細胞外基質(zhì)和基底膜的降解、促進腫瘤侵襲轉移過程中起核心作用。其他多種惡性腫瘤（包括肺癌、胰腺癌、胃癌、直結腸癌、前列腺癌等）研究中發(fā)現(xiàn)u-PA的激活與腫瘤侵襲力有關?，F(xiàn)已證實體內(nèi)多種因子如TGF

4、、IGF、EGF、KGF、IL-1等均能調(diào)控u-PA表達，但迄今為止對其表達的分子調(diào)控機制研究較少。
　　 EGF與其受體結合后誘導MAPK的磷酸化級聯(lián)反應，是EGF誘導的重要反應。p38是MAPK家族中的一員，是一組細胞內(nèi)信號轉導分子，p38MAPK上游的MAPKK通過磷酸化p38MAPK的Thr-Gly-Tyr位點中的蘇氨酸和酪氨酸使其活化，活化的p38MAPK進一步調(diào)控下游多種基因的表達，參與調(diào)控炎癥、細胞生長、細胞分化，

5、細胞周期及細胞死亡、侵襲表型等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號轉導通路參與胃癌、肺癌、淋巴瘤及乳腺癌等細胞u-PA的表達調(diào)控。目前尚未見關于p38MAPK信號轉導通路與食管腺癌SEG-1細咆侵襲關系的相關報道。
　　 為此，本研究從EGF著手，通過對p38MAPK信號轉導通路的特異性阻斷，觀察阻斷前后p38MAPK蛋白、u-PA表達變化，研究p38MAPK信號轉導通路在EGF誘導SFG-1細胞表達u-PA中的作用，探討食管腺

6、癌細胞侵袋機制。
　　 目的：探討EGF通過p38MAPK信號轉導通路誘導SEG-1細胞表達u-PA促進腫瘤侵襲的機制。
　　 方法：采用體外細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)食管腺癌SEG-1細胞，以相同濃度的EGF（100ng/ml）按時間梯度刺激SEG-1細胞，應用Western blot法測定各時間點總p38MAPK蛋白、磷酸化p38MAPK蛋白、u-PA蛋白表達，應用RT-PCR方法檢測各時間點u-PA mRNA表達。用p38M

7、APK特異抑制劑SB203580預處理細胞后，觀察上述指標變化。
　　 結果：①EGF對SEG-1細胞p38MAPK蛋白表達的影響：應用Westem blot方法檢測p38MAPK蛋白表達，結果顯示大約在43KD位置出現(xiàn)p-p38MAPK特異性條帶，在38KD位置出現(xiàn)t-p38MAPK特異性條帶。EGF作用于SEG-1細胞后p38MAPK磷酸化程度有所升高，磷酸化程度隨EGF作用時間的變化而變化：1h，6h，12h，24h，48

8、h的p38MAPK磷酸化的百分比分別為11.2％，26.4％，37.6％，55.2％，41.1％?？梢?4h的p38MAPK磷酸化水平最高，因此認為該時間點為p38MAPK最高大磷酸化時間點。②EGF對SEG-1細胞u-PA mRNA和蛋白表達的影響：應用RT-PCR方法檢測u-PA mRNA表達，結果顯示人食管腺癌細胞（SEG-1）中有u-PA基因表達，隨著EGF作用時間的延長，u-PA mRNA的表達水平逐漸上升：EGF作用于SEG

9、-1細胞1h后u-PAmRNA表達為：0.265±0.057，與對照組（0.259±0.064）相比，p>0.05，無統(tǒng)計學意義；EGF作用于SEG-1細胞6h后，u-PAmRNA表達為0.306±0.061，與對照組（0.259±0.064）相比，u-PAmRNA表達升高，有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；EGF作用于SEG-1細胞12h、24h、48h后u-PA mRNA分別表達為：0.642±0.049，0.894±0.045，0.7

10、25±0.051，與對照組（0.259±0.064）相比，u-PAmRNA表達明顯升高，有統(tǒng)計學意義（p<0.01）。可見本實驗中u-PA mRNA表達隨EGF作用時間逐漸升高，于24h達高峰，后又逐漸下降。Westem blot方法檢測u-PA蛋白表達，結果顯示EGF刺激前SEG-1細胞u-PA蛋白表達量較低，刺激后6h開始上升，持續(xù)至24h達最高，后又逐漸下降，呈明顯的時間依賴性。EGF作用于SEG-1細胞1h后u-PA蛋白表達為0

11、.291±0.063，與對照組（0.288±0.036）比較，p>0.05，無統(tǒng)計學意義。作用6h后u-PA蛋白表達為0.458±0.069與對照組（0.288±0.036）比較，表達升高，p<0.05，有統(tǒng)計學意義。作用12h、24h、48h后，u-PA蛋白表達為0.705±0.056、0.0845±0.049、0.756±0.042，與對照組（0.288±0.036、）比較，表達明顯升高，p<0.01，有統(tǒng)計學意義。③p38MAPK

12、特異抑制劑SB203580可明顯抑制EGF誘導的p38MAPK激酶活力，對EGF誘導的SEG-1細胞內(nèi)u-PA mRNA和蛋白的表達亦有明顯的抑制作用。5μmol/L、10μmol/L、20μmol/LSB203580與EGF同時作用與細胞后p38MAPK磷酸化的百分比分別為36.2％，19.3％，7.1％，明顯低于EGF組p38MAPK磷酸化的百分值51.4％。SB203580（5μmol/L）+EGF組、SB203580（10μmo

13、l/L）+EGF組u-PA mRNA表達分別為0.718±0.029，0.607±0.047，與EGF組0.853±0.034相比，p<0.05，表達下降，有統(tǒng)計學意義。EGF+SB203580（20μmol/L）組表達量為0.313±0.034與EGF組0.853±0.034相比，p<0.01，表達明顯下降，有統(tǒng)計學意義SB203580（5μmol/L）+EGF組、SB203580（10μmol/L）+EGF組u-PA蛋白表達分別為0

14、.708±0.048，0.654±0.052，與EGF組0.805±0.042相比，p<0.05，表達下降，有統(tǒng)計學意義。SB203580（20μmol/L）+EGF組表達量為0.303±0.045與EGF組0.805±0.042相比，p<0.01，表達明顯下降，有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：①EGF可引起p38MAPK蛋白磷酸化，在相同濃度EGF（100ng/ml）作用下，p38MAPK蛋白的磷酸化呈時間依賴性，最大磷酸化的作用