p38MAPK在周期性牽張力對人頜面部增生性瘢痕成纖維細胞分化影響中的作用.pdf

1、p 3 8 M A P K 在周期性牽張力對人頜面部增生性瘢痕成纖維細胞分化影晌中的作用摘要目的：增生性瘢痕組織的形成是創(chuàng)口愈合過程中不可避免的，并且產生了很多不良的影響。尤其在口腔頜面外科許多唇腭裂的患兒做完修復手術后常常需要做二期手術來進一步改善面容，在傷口愈合過程中形成的瘢痕會影響他們的美觀和功能，進而影響患者的心理。傷口愈合過程中受到多種因素的影響，牽張力、成纖維細胞和平滑肌肌動蛋白( Q —S M A ) 是傷口愈合不可缺少的

2、三個要素。但是牽張力的存在促進了傷口過度愈合形成增生性瘢痕。在此過程中，牽張力如何被細胞感受并傳遞至細胞內環(huán)境，從而導致細胞發(fā)生一系列生物學效應的確切機制尚不十分清楚。細胞力學是組織工程和細胞工程的基礎之一，隨著細胞力學的發(fā)展，常常要研究機械力對細胞形態(tài)變化、生長和分化的影響。本研究擬在成功構建瘢痕成纖維細胞體外原代培養(yǎng)一力學刺激模型的基礎上，探討p 3 8 M A P K 在張應力介導的瘢痕成纖維細胞分化中的作用及調控機制，從而闡明機

3、械應力作用下瘢痕成纖維細胞改建的分子調控機制，這將幫助口腔頜面外科臨床醫(yī)生采用不同的方法誘導或者調控瘢痕形成，具有重要的指導意義。方法：增生性瘢痕成纖維細胞原代培養(yǎng)體系的建立與細胞培養(yǎng)：取唇腭裂患者二期修復術切下的瘢痕組織，應用機械分離一酶消化聯合法對瘢痕成纖維細胞進行原代體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學表現及波形蛋白染色進行瘢痕成纖維細胞表型鑒定。以體外原代培養(yǎng)的瘢痕成纖維細胞為研究對象，通過成功構建瘢痕成纖維細胞體外培養(yǎng)一力學刺

4、激模型，使用多通道細胞牽張應力加載系統(tǒng)，對待測細胞持續(xù)加載O h 、6 h 、1 2 h 的周期性張應力，其中力值為1 0 ％的細胞形變，頻率為1 0c y c l e s ／m i n ，加力0 h 組為對照組，使用相差顯微鏡從形態(tài)學上觀察不同持續(xù)時間的張應力對成纖維細胞的影響，通過p 3 8 M A P K 表達的量來檢查不同組之間p 3 8 M A P K 的表達，通過R T —P C R 檢測周期性張應力下不同組之間a —S M

5、 Am R N A 和T G F 一1 3l m R N A 表達的變化，通過W e s t e r nb l o t 檢測周期性張應力下不同組之間Q —S M A 、T G F - 81 和p 3 8 M A P K 蛋白的表達變化，然后應用p 3 8 M A P K 特異性的抑制劑S B 2 0 3 5 8 0 來明確p 3 8 M A P K 在應力介導的成纖維細胞分化中的作用。應用S P S S l 7 ．0 統(tǒng)計軟件對實驗數據

6、進行統(tǒng)計學分析。結果：1 ．采用機械分離一酶消化聯合法瘢痕成纖維細胞體外培養(yǎng)體系，經過倒置顯微鏡觀察及波形蛋白染色鑒定，確認分離培養(yǎng)的細胞符合成纖維細胞的生物學特A b s t r a c tO b j e c t i v e ：I n t h ep r o c e s so f w o u n d h e a l i n g t h e h y p e r t r o p h i cs c a r ( H T S ) i s i n

7、e v i t a b l e ，a n dp r o d u c e d al o to fa d v e r s ee f f e c t s ．M a n yc h i l d r e no f c l e f tl i pa n dp a l a t e ( C L P )w e r e s u f f e r e do p e r a t i o nt o r e p a i rt h ed e f e c t ．b u t

8、t h es c a rf o r m a t i o na f f e c t e df a c i a la p p e a r a n c ea n d f u n c t i o n ．T h e y u s u a l l yh a d t os u f f e rt h e s e c o n do p e r a t i o nf o rr e v i s i n gt h ef a c i a ls c a r ．T h

9、 ew o u n d h e a l i n gp r o c e s s i Si n f l u e n c e d b ys o m e f a c t o r s ．t h et e n s i o n ．f i b r o b l a s t s a n d as m o o t h m u s c l e a c t i n ( Q —S M A ) a r et h e t h r e e i n d i s p e n

10、 s a b l ee l e m e n t so f w o u n d h e a l i n gp r o c e s s ．B u t t h et e n s i o ne x i s t e n c ec a n p r o m o t e t h ew o u n dh e a l i n g o f h y p e r p l a s t i cs c a r ．I ti sn e c e s s a r y t h

11、a tw e d e e p l yr e s e a r c hi n t ot h e m e c h a n i c so f m u s c l ec e l l s i nt h e p r o c e s so f s i g n a lt r a n s d u c t i o nm e c h a n i s m f o rc l a r i f y i n gf u n c t i o no r t h o p e d

12、 i c s k e l e t a l m u s c l e r e m o d e l i n g m e c h a n i s m s ．C e l l u l a r m e c h a n i c s i S t h ef o u n d a t i o no f t h et i s s u e e n g i n e e r i n ga n dc e l l e n g i n e e r i n g ，w i t

13、ht h ed e v e l o p m e n to fc e l lm e c h a n i c s ，w en e e ds t u d yt h em e c h a n i c a ls t r e s s i n f l u e n c e c e l l sm o r p h o l o g y 、g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n ．T h e r e f

14、o r e ，i n t h i s r e s e a r c h ，s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t sf i b r o b l a s t si n v i t r om o d e lo fm e c h a n i c a ls t i m u l a t i o n ．t o s t u d yt h ee f f e c t s o fc y c l i cs t r e

15、 t c h o n t h e p 3 8 M A P Ks i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y i n v i t r o a n d f i b r o b l a s t st r a n s d i f f e r e n t i a t i o n b y c y c l i c s t r e t c h i n h u m a nH T Sf i b r o b

16、 l a s t s ．T h i sw i Uh e l p sc l i n i c a l d o c t o ru s e d d i f f e r e n t o fm e t h o da n dm e a n si n d u c e do rr e g u l a t i o n w o u n dh e a l i n g ，p r o v i d i n gm a n y t h e o r e t i c a l

17、 g u i d a n c e ．M e t h o d s ：P r i m a r yc u l t u r e so f h y p e r t r o p h i c s c a rf i b r o b l a s t sw e r ee s t a b l i s h e df r o mM a n yc h i l d r e n o fc l e f tl i pa n dp a l a t e ( C L P ) b

18、 y m e c h a n i c a l s e p a r a t i o n ．e n z y m ed i g e s t i o nm e t h o d ．C e l l m o r p h o l o g ya n dv i m e n t i nw e r e u s e di d e n t i f i c a t i o nt h ec e l lp h e n o t y p eu n d e rt h e m

19、i c r o s c o p e ．I nt h i s s t u d y , c y c l i c s t r e t c hw a sa p p l i e d o nt h ef i b r o b l a s t sf o r0 ，6a n d12 h o u r s ，m y o f i b r o b l a s t sw e r es u b j e c t e dt o 10 ％e l o n g a t i o

20、n ；w i t hf r e q u e n c yo f10 c y c l e sp e rm i n u t e ，e a c hc y c l e si n c l u d i n gt h e3 ．s t r e t c h a n d3 - sr e l a x a t i o n ．T m m e d i a t e l ya f t e rt h ec y c l i cs t r e t c h ，w eu s e

21、dm o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f p r i m a r yc u l t u r e dH T S f i b r o b l a s t sb yi m m u n o f l u o r e s c e n c e ．a n dt h e p 3 8 M A P Ka c t i v i t y w

22、a s d e t e c t e d b y p 3 8 M A P K A c t i v i t y A s s a y K i t ．W ei n v e s t i g a t e d 也er o l e o fp 3 8 M A P K i n c y c l i cs t r e t c h ．i n d u c e dt r a n s d i f f e r e n t i a t i o n i nm y o f i

23、 b r o b l a s t s ．T h ee x p r e s s i o nl e v e l so f Q ．S M A m R N A 、T G F ．B 1 m R N A 、Q—S M Ap r o t e i n 、T G F - B 1 p r o t e i n ．a n d p 3 8 M A P K p r o t e i nw e r e d e t e c t e du s i n gI 弭P C Ra

24、 n dW e s t e r nb l o t ．A n dt h e n ，w e u s e d2 0 u Mo ft h e p 3 8 M A P K i n h i b i t o r ．S B 2 0 3 5 8 0 t o d e t e r m i n e t h e o f p 3 8 M A P K i n c y c l i c s t r e t c h ．i n d u c e dt r a n s d i

25、f f e r e n t i a t i o ni nm y o f i b r o b l a s t s ．T oa s s e s st h ed i f f e r e n c eb e t w e e n e a c hg r o u p s ．w e u s e ds t a t i s t i c a la n a l y s i ss o f t w a r e ( S P S S 17 ．0 1 ．R e s u l

26、 t s ：1 ．M e c h a n i c a l s e p a r a t i o n —e n z y m e d i g e s t i o n c o m b i n e m e t h o d s u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e d h y p e r t r o p h i cs c a rf i b r o b l a s t si nv i t r oc u l