p38MAPK在周期性牽張力對(duì)人頜面部增生性瘢痕成纖維細(xì)胞分化影響中的作用.pdf

1、p 3 8 M A P K 在周期性牽張力對(duì)人頜面部增生性瘢痕成纖維細(xì)胞分化影晌中的作用摘要目的：增生性瘢痕組織的形成是創(chuàng)口愈合過(guò)程中不可避免的，并且產(chǎn)生了很多不良的影響。尤其在口腔頜面外科許多唇腭裂的患兒做完修復(fù)手術(shù)后常常需要做二期手術(shù)來(lái)進(jìn)一步改善面容，在傷口愈合過(guò)程中形成的瘢痕會(huì)影響他們的美觀和功能，進(jìn)而影響患者的心理。傷口愈合過(guò)程中受到多種因素的影響，牽張力、成纖維細(xì)胞和平滑肌肌動(dòng)蛋白( Q —S M A ) 是傷口愈合不可缺少的

2、三個(gè)要素。但是牽張力的存在促進(jìn)了傷口過(guò)度愈合形成增生性瘢痕。在此過(guò)程中，牽張力如何被細(xì)胞感受并傳遞至細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一系列生物學(xué)效應(yīng)的確切機(jī)制尚不十分清楚。細(xì)胞力學(xué)是組織工程和細(xì)胞工程的基礎(chǔ)之一，隨著細(xì)胞力學(xué)的發(fā)展，常常要研究機(jī)械力對(duì)細(xì)胞形態(tài)變化、生長(zhǎng)和分化的影響。本研究擬在成功構(gòu)建瘢痕成纖維細(xì)胞體外原代培養(yǎng)一力學(xué)刺激模型的基礎(chǔ)上，探討p 3 8 M A P K 在張應(yīng)力介導(dǎo)的瘢痕成纖維細(xì)胞分化中的作用及調(diào)控機(jī)制，從而闡明機(jī)

3、械應(yīng)力作用下瘢痕成纖維細(xì)胞改建的分子調(diào)控機(jī)制，這將幫助口腔頜面外科臨床醫(yī)生采用不同的方法誘導(dǎo)或者調(diào)控瘢痕形成，具有重要的指導(dǎo)意義。方法：增生性瘢痕成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)體系的建立與細(xì)胞培養(yǎng)：取唇腭裂患者二期修復(fù)術(shù)切下的瘢痕組織，應(yīng)用機(jī)械分離一酶消化聯(lián)合法對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及波形蛋白染色進(jìn)行瘢痕成纖維細(xì)胞表型鑒定。以體外原代培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)成功構(gòu)建瘢痕成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)一力學(xué)刺

4、激模型，使用多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)，對(duì)待測(cè)細(xì)胞持續(xù)加載O h 、6 h 、1 2 h 的周期性張應(yīng)力，其中力值為1 0 ％的細(xì)胞形變，頻率為1 0c y c l e s ／m i n ，加力0 h 組為對(duì)照組，使用相差顯微鏡從形態(tài)學(xué)上觀察不同持續(xù)時(shí)間的張應(yīng)力對(duì)成纖維細(xì)胞的影響，通過(guò)p 3 8 M A P K 表達(dá)的量來(lái)檢查不同組之間p 3 8 M A P K 的表達(dá)，通過(guò)R T —P C R 檢測(cè)周期性張應(yīng)力下不同組之間a —S M

5、 Am R N A 和T G F 一1 3l m R N A 表達(dá)的變化，通過(guò)W e s t e r nb l o t 檢測(cè)周期性張應(yīng)力下不同組之間Q —S M A 、T G F - 81 和p 3 8 M A P K 蛋白的表達(dá)變化，然后應(yīng)用p 3 8 M A P K 特異性的抑制劑S B 2 0 3 5 8 0 來(lái)明確p 3 8 M A P K 在應(yīng)力介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞分化中的作用。應(yīng)用S P S S l 7 ．0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

6、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：1 ．采用機(jī)械分離一酶消化聯(lián)合法瘢痕成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，經(jīng)過(guò)倒置顯微鏡觀察及波形蛋白染色鑒定，確認(rèn)分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特A b s t r a c tO b j e c t i v e ：I n t h ep r o c e s so f w o u n d h e a l i n g t h e h y p e r t r o p h i cs c a r ( H T S ) i s i n

7、e v i t a b l e ，a n dp r o d u c e d al o to fa d v e r s ee f f e c t s ．M a n yc h i l d r e no f c l e f tl i pa n dp a l a t e ( C L P )w e r e s u f f e r e do p e r a t i o nt o r e p a i rt h ed e f e c t ．b u t

8、t h es c a rf o r m a t i o na f f e c t e df a c i a la p p e a r a n c ea n d f u n c t i o n ．T h e y u s u a l l yh a d t os u f f e rt h e s e c o n do p e r a t i o nf o rr e v i s i n gt h ef a c i a ls c a r ．T h

9、 ew o u n d h e a l i n gp r o c e s s i Si n f l u e n c e d b ys o m e f a c t o r s ．t h et e n s i o n ．f i b r o b l a s t s a n d as m o o t h m u s c l e a c t i n ( Q —S M A ) a r et h e t h r e e i n d i s p e n

10、 s a b l ee l e m e n t so f w o u n d h e a l i n gp r o c e s s ．B u t t h et e n s i o ne x i s t e n c ec a n p r o m o t e t h ew o u n dh e a l i n g o f h y p e r p l a s t i cs c a r ．I ti sn e c e s s a r y t h

11、a tw e d e e p l yr e s e a r c hi n t ot h e m e c h a n i c so f m u s c l ec e l l s i nt h e p r o c e s so f s i g n a lt r a n s d u c t i o nm e c h a n i s m f o rc l a r i f y i n gf u n c t i o no r t h o p e d

12、 i c s k e l e t a l m u s c l e r e m o d e l i n g m e c h a n i s m s ．C e l l u l a r m e c h a n i c s i S t h ef o u n d a t i o no f t h et i s s u e e n g i n e e r i n ga n dc e l l e n g i n e e r i n g ，w i t

13、ht h ed e v e l o p m e n to fc e l lm e c h a n i c s ，w en e e ds t u d yt h em e c h a n i c a ls t r e s s i n f l u e n c e c e l l sm o r p h o l o g y 、g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n ．T h e r e f

14、o r e ，i n t h i s r e s e a r c h ，s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t sf i b r o b l a s t si n v i t r om o d e lo fm e c h a n i c a ls t i m u l a t i o n ．t o s t u d yt h ee f f e c t s o fc y c l i cs t r e

15、 t c h o n t h e p 3 8 M A P Ks i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y i n v i t r o a n d f i b r o b l a s t st r a n s d i f f e r e n t i a t i o n b y c y c l i c s t r e t c h i n h u m a nH T Sf i b r o b

16、 l a s t s ．T h i sw i Uh e l p sc l i n i c a l d o c t o ru s e d d i f f e r e n t o fm e t h o da n dm e a n si n d u c e do rr e g u l a t i o n w o u n dh e a l i n g ，p r o v i d i n gm a n y t h e o r e t i c a l

17、 g u i d a n c e ．M e t h o d s ：P r i m a r yc u l t u r e so f h y p e r t r o p h i c s c a rf i b r o b l a s t sw e r ee s t a b l i s h e df r o mM a n yc h i l d r e n o fc l e f tl i pa n dp a l a t e ( C L P ) b

18、 y m e c h a n i c a l s e p a r a t i o n ．e n z y m ed i g e s t i o nm e t h o d ．C e l l m o r p h o l o g ya n dv i m e n t i nw e r e u s e di d e n t i f i c a t i o nt h ec e l lp h e n o t y p eu n d e rt h e m

19、i c r o s c o p e ．I nt h i s s t u d y , c y c l i c s t r e t c hw a sa p p l i e d o nt h ef i b r o b l a s t sf o r0 ，6a n d12 h o u r s ，m y o f i b r o b l a s t sw e r es u b j e c t e dt o 10 ％e l o n g a t i o

20、n ；w i t hf r e q u e n c yo f10 c y c l e sp e rm i n u t e ，e a c hc y c l e si n c l u d i n gt h e3 ．s t r e t c h a n d3 - sr e l a x a t i o n ．T m m e d i a t e l ya f t e rt h ec y c l i cs t r e t c h ，w eu s e

21、dm o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f p r i m a r yc u l t u r e dH T S f i b r o b l a s t sb yi m m u n o f l u o r e s c e n c e ．a(chǎn) n dt h e p 3 8 M A P Ka c t i v i t y w

22、a s d e t e c t e d b y p 3 8 M A P K A c t i v i t y A s s a y K i t ．W ei n v e s t i g a t e d 也er o l e o fp 3 8 M A P K i n c y c l i cs t r e t c h ．i n d u c e dt r a n s d i f f e r e n t i a t i o n i nm y o f i

23、 b r o b l a s t s ．T h ee x p r e s s i o nl e v e l so f Q ．S M A m R N A 、T G F ．B 1 m R N A 、Q—S M Ap r o t e i n 、T G F - B 1 p r o t e i n ．a(chǎn) n d p 3 8 M A P K p r o t e i nw e r e d e t e c t e du s i n gI 弭P C Ra

24、 n dW e s t e r nb l o t ．A n dt h e n ，w e u s e d2 0 u Mo ft h e p 3 8 M A P K i n h i b i t o r ．S B 2 0 3 5 8 0 t o d e t e r m i n e t h e o f p 3 8 M A P K i n c y c l i c s t r e t c h ．i n d u c e dt r a n s d i

25、f f e r e n t i a t i o ni nm y o f i b r o b l a s t s ．T oa s s e s st h ed i f f e r e n c eb e t w e e n e a c hg r o u p s ．w e u s e ds t a t i s t i c a la n a l y s i ss o f t w a r e ( S P S S 17 ．0 1 ．R e s u l

26、 t s ：1 ．M e c h a n i c a l s e p a r a t i o n —e n z y m e d i g e s t i o n c o m b i n e m e t h o d s u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e d h y p e r t r o p h i cs c a rf i b r o b l a s t si nv i t r oc u l