IL-10通過P38MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)IL-1β對(duì)肺成纖維細(xì)胞ICAM-1的表達(dá).pdf

1、目的:本研究以大鼠胚肺成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，通過對(duì)其ICAM-1表達(dá)水平及P38MAPK磷酸化水平的觀察，探究IL-1β通過P38MAPK信號(hào)通路對(duì)ICAM-1表達(dá)水平的影響及IL-10對(duì)該影響作用的干預(yù)，進(jìn)一步了解肺纖維化的部分發(fā)病機(jī)制，為臨床治療新思路提供依據(jù)。
　　方法:采用組織切塊培養(yǎng)技術(shù)對(duì)Wistar鼠胚肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng):將臨產(chǎn)Wistar孕鼠吸入乙醚麻醉后，立刻取出胎鼠，將胎鼠肺組織取出后修剪為1mm3左右的小塊并

2、加入含胎牛血清(20％)的DMEM培養(yǎng)基;培養(yǎng)條件:恒溫37℃，95％空氣及5％C02混合氣體，濕度飽和，培養(yǎng)4至6小時(shí)，一周左右后開始傳代，至5-6代后待所培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)且結(jié)構(gòu)特征、外部形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致遂進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　首先將實(shí)驗(yàn)用肺成纖維細(xì)胞以1×105/ml在預(yù)先放置有6mm×22mm蓋玻片（已消毒）的6孔板中進(jìn)行接種;之后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育至達(dá)到細(xì)胞80％-100％融合，棄掉原培養(yǎng)液并加入新培養(yǎng)液

3、（不含胎牛血清），進(jìn)一步培養(yǎng)12小時(shí)，待G0期細(xì)胞基本同步化時(shí)，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為三組，每組6復(fù)孔。分組情況:(1)對(duì)照組:單純加入DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)鼠胚肺成纖維細(xì)胞，共6小時(shí);(2)IL-1β干預(yù)組:加入含IL-1β15ng/ml的培養(yǎng)液培養(yǎng)鼠胚肺成纖維細(xì)胞，共6小時(shí);(3) IL-10+IL-1β干預(yù)組:加入IL-1010ng/ml及IL-1β15ng/ml共同刺激肺成纖維細(xì)胞6小時(shí)。
　　以RT-PCR法檢測(cè)肺成纖維細(xì)胞ICAM

4、-1mRNA表達(dá)水平，以Western-Blot法檢測(cè)肺成纖維細(xì)胞P38MAPK磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　1.對(duì)Wistar胎鼠的原代肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)成功實(shí)驗(yàn)以組織切塊培養(yǎng)法進(jìn)行Wistar胎鼠的肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，最后得到比較理想的生長(zhǎng)狀況較好的肺成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，其?xì)胞間形態(tài)較為一致，胞質(zhì)均勻，胞體豐滿，核仁及核分裂相清晰可見。
　　2.RT-PCR法對(duì)肺成纖維細(xì)胞中ICAM-1 mRNA表達(dá)水平的測(cè)定ICAM

5、-1 mRNA電泳條帶的光密度掃描顯示:對(duì)照組的肺成纖維細(xì)胞中ICAM-1 mRNA有一定量的基礎(chǔ)表達(dá)，但其表達(dá)量較低，為（0.361±0.045）; IL-1β干預(yù)組的ICAM-1 mRNA的表達(dá)量為（0.848±0.039），與對(duì)照組相比明顯升高（P＜0.01）;IL-10+IL-1β聯(lián)合干預(yù)組ICAM-1 mRNA的表達(dá)量為（0.740±0.026），明顯低于IL-1β干預(yù)組的表達(dá)量(P＜0.01)，但與對(duì)照組相比其表達(dá)量有所升高

6、(P＜0.01)。
　　3.WesternBlot法測(cè)定肺成纖維細(xì)胞P-P38蛋白表達(dá)水平的變化磷酸化P38(P-P38)蛋白在肺成纖維細(xì)胞中存在基礎(chǔ)表達(dá)，對(duì)照組為(0.581±0.034); IL-1β干預(yù)組P-P38蛋白表達(dá)為(1.196±0.038)，明顯高于對(duì)照組(P＜0.01); IL-10+IL-1β聯(lián)合干預(yù)組P-P38蛋白表達(dá)為(0.780±0.028)，明顯低于IL-1β干預(yù)組（P＜0.01），但高于對(duì)照組，具有統(tǒng)