多組學(xué)整合在肝癌惡性進(jìn)展研究中的應(yīng)用與相關(guān)分子機(jī)制探討.pdf

1、第一部分:轉(zhuǎn)錄組和蛋白組整合分析鑒定乙醛脫氫酶2 ALDH2在肝癌惡性進(jìn)展的作用及機(jī)制研究
　　研究背景和目的:
　　原發(fā)性肝癌是最常見(jiàn)的肝臟惡性腫瘤，也是中國(guó)最常見(jiàn)最致命的的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在惡性腫瘤中居第四位，而死亡率則位居腫瘤相關(guān)死亡的第三位，且是60歲以下男性中最常見(jiàn)和死亡率最高的腫瘤，居肝硬化病人相關(guān)死亡原因的首位。對(duì)于早期診斷的肝臟腫瘤病人，可以通過(guò)肝臟切除術(shù)、射頻消融術(shù)、動(dòng)脈化療栓塞和肝移植，獲得較好的治

2、療效果。但是大部分肝臟腫瘤病人初次確診時(shí)即為晚期，由于大血管癌栓、包膜不完整、子灶和腫瘤多發(fā)等情況的存在，手術(shù)后仍然有相當(dāng)高的復(fù)發(fā)率轉(zhuǎn)移率，預(yù)后結(jié)果不理想，我國(guó)的肝癌診療形勢(shì)依然相當(dāng)嚴(yán)峻，早期診斷困難、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、治療手段少以及個(gè)性化治療缺乏等仍然是肝癌診療工作中面臨的主要問(wèn)題。因此，急需探索新的診療方法，鑒定新的特異的肝癌進(jìn)展分子標(biāo)記，以建立更全面更有效的分子分型分層系統(tǒng)，并深入探討肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制，這對(duì)于選擇行之

3、有效的治療方式，減少肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，提高患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)患者的生存期至關(guān)重要。
　　整合多個(gè)層次的組學(xué)數(shù)據(jù)，是全面而系統(tǒng)認(rèn)識(shí)和研究肝細(xì)胞癌的一個(gè)重要方向。包括TCGA(The Cancer Genome Atlas)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)內(nèi)和國(guó)際的研究項(xiàng)目為數(shù)據(jù)的整合提供了重要的資源，但是怎樣整合多個(gè)組學(xué)的數(shù)據(jù)依然是困擾著肝癌研究的一個(gè)難題。其中，通過(guò)將多個(gè)組學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)行累加，尋找他們之間的共性，是目前使用的一種比較簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)整合

4、方式。我們利用50例肝癌患者癌和癌旁的組織樣本進(jìn)行RNA測(cè)序（14例高轉(zhuǎn)移樣本，13例低轉(zhuǎn)移樣本），對(duì)高轉(zhuǎn)移和低轉(zhuǎn)移的混合樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組測(cè)序，通過(guò)整合分析，尋找到了在肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中表達(dá)變化頻率比較高的酶，乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase-2，ALDH2）。
　　乙醛脫氫酶2 ALDH2，是醛脫氫酶的一種，負(fù)責(zé)催化乙醛氧化為乙酸的反應(yīng)。在正常的生理狀態(tài)下，肝中的乙醇脫氫酶負(fù)責(zé)將乙醇（酒的成分）氧化為乙

5、醛，生成的乙醛作為底物進(jìn)一步在乙醛脫氫酶2 ALDH2的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)害的乙酸，進(jìn)而分解成二氧化碳CO2和水H2O排出體外，從而使乙醛脫氫酶2 ALDH2扮演著重要的抗氧化應(yīng)激分子角色，減少了乙醛的細(xì)胞毒性。以往的研究揭示，在病理狀態(tài)下，由于乙醛脫氫酶2 ALDH2活性的降低或喪失，導(dǎo)致其催化乙醛的能力減弱，大量的乙醛在體內(nèi)堆積引起了一系列的病理生理反應(yīng)，造成飲酒后出現(xiàn)面部潮紅、心跳加速等臉面潮紅綜合征現(xiàn)象，并可作為獨(dú)立因素和飲酒與食管

6、癌高風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)使臉面潮紅綜合征、飲酒和腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)研究受到關(guān)注，但由于腫瘤的類(lèi)型不同、患病人群各異，研究結(jié)果不盡一致。那么，在肝癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過(guò)程中，乙醛脫氫酶2 ALDH2的表達(dá)情況如何，發(fā)揮著什么樣的作用，以及如何發(fā)揮作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　研究方法:
　　1.收集相關(guān)臨床肝癌患者樣本，進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)組測(cè)序，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)關(guān)聯(lián)分析，篩選目標(biāo)分子;
　　2.收集臨床肝癌樣本，經(jīng)real-time

7、PCR、Western blot、免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)乙醛脫氫酶2 ALDH2在肝癌組織中mRNA水平、蛋白水平的表達(dá)情況;
　　3.收集整理上述肝癌患者臨床病理信息和隨訪預(yù)后資料，同時(shí)挖掘TCGA公用數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和預(yù)后分析，探討ALDH2表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性，繪制receiving operating curve(ROC)曲線(xiàn)，計(jì)算area under curve(AUC)，評(píng)估乙醛脫氫酶2 ALDH2在肝癌病人中

8、的臨床診斷價(jià)值，以及對(duì)肝癌患者的總體生存和術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值;
　　4.利用慢病毒系統(tǒng)建立ALDH2過(guò)表達(dá)細(xì)胞系和siRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)調(diào)節(jié)ALDH2的表達(dá)，采用cell counting kit-8(CCK8)實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)、Matrigel穿膜侵襲實(shí)驗(yàn)觀察高低表達(dá)ALDH2對(duì)肝癌細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力的影響;同時(shí)利用酶活性檢測(cè)技術(shù)、基因位點(diǎn)定點(diǎn)突變技術(shù)，檢測(cè)對(duì)ALDH2酶活性、蛋白表

9、達(dá)量以及對(duì)肝癌細(xì)胞遷移功能的影響;
　　5.利用裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型及脾靜脈注射肝轉(zhuǎn)移模型，研究過(guò)表達(dá)ALDH2對(duì)肝癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響;
　　6.利用real-time PCR、Western blot技術(shù)，結(jié)合表達(dá)譜芯片測(cè)序技術(shù)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，研究ALDH2對(duì)AMPK等信號(hào)通路的影響;
　　7.利用Western blot技術(shù)，結(jié)合激活劑實(shí)驗(yàn)、抑制劑實(shí)驗(yàn)和siRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)調(diào)節(jié)ALDH2的表達(dá)，研

10、究ALDH2與AMPK的關(guān)系及對(duì)其功能的影響;同時(shí)利用乙醛靶向檢測(cè)技術(shù)研究ALDH2對(duì)乙醛催化的作用，利用外源性添加乙醛的方法探討其對(duì)肝癌細(xì)胞遷移功能的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.RNA測(cè)序和蛋白質(zhì)組測(cè)序整合分析提示，肝癌臨床樣本中乙醛脫氫酶2ALDH2在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均較癌旁組織顯著降低;
　　2.在擴(kuò)大肝癌臨床樣本中，乙醛脫氫酶2 ALDH2在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著低于癌旁組織，在轉(zhuǎn)移能力較高的組織中表達(dá)

11、水平更低;在檢測(cè)的5種肝癌細(xì)胞系中，細(xì)胞系轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，乙醛脫氫酶2 ALDH2的蛋白表達(dá)水平越低;
　　3.在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和所檢測(cè)的臨床樣本中，乙醛脫氫酶2 ALDH2低表達(dá)可以提示更具侵襲特點(diǎn)的臨床病理特性和肝癌患者更差的預(yù)后，且具有一定的診斷價(jià)值;
　　4.體外實(shí)驗(yàn)提示，過(guò)表達(dá)乙醛脫氫酶2 ALDH2能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力;干擾乙醛脫氫酶2 ALDH2則能夠明顯提高肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力;過(guò)表達(dá)乙醛脫

12、氫酶2 ALDH2主要是通過(guò)提高ALDH2的酶活性而發(fā)揮作用;
　　5，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提示，在尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型和脾靜脈注射肝轉(zhuǎn)移模型中，過(guò)表達(dá)乙醛脫氫酶2 ALDH2能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力;
　　6.過(guò)表達(dá)乙醛脫氫酶2 ALDH2可以活化AMPK相關(guān)的信號(hào)通路，與調(diào)控肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力有關(guān);
　　7.激活劑實(shí)驗(yàn)、抑制劑實(shí)驗(yàn)和siRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)調(diào)節(jié)AMPK表達(dá)實(shí)驗(yàn)提示，乙醛脫氫酶2 ALDH2通過(guò)活化AM

13、PK相關(guān)信號(hào)通路而影響肝癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展，且與影響細(xì)胞內(nèi)的氧化還原水平有關(guān);同時(shí)過(guò)表達(dá)乙醛脫氫酶2 ALDH2可影響細(xì)胞內(nèi)的乙醛水平而影響肝癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展。
　　結(jié)論:
　　本研究工作發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌中乙醛脫氫酶2 ALDH2表達(dá)水平在癌中較癌旁明顯降低，在轉(zhuǎn)移能力較高的肝癌組織中表達(dá)水平更低，通過(guò)大樣本肝癌患者組織驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)這種低表達(dá)與肝癌的惡性臨床病理指標(biāo)具有明顯的相關(guān)性，單因素和多因素分析進(jìn)一步揭示乙醛脫氫酶2

14、ALDH2是獨(dú)立的術(shù)后預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素，且具有一定的臨床診斷價(jià)值。體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明過(guò)表達(dá)乙醛脫氫酶2 ALDH2可以有效的抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并且這種能力主要是通過(guò)活化AMPK相關(guān)的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。我們首次報(bào)道了與肝癌惡性進(jìn)展相關(guān)的乙醛脫氫酶2 ALDH2和AMPK信號(hào)通路的相互作用，這種相互作用可能是通過(guò)乙醛脫氫酶2 ALDH2影響細(xì)胞內(nèi)的氧化還原水平實(shí)現(xiàn)的。綜上所述，乙醛脫氫酶2 ALDH2在肝癌的惡性進(jìn)展中起到了重

15、要的作用，可能是肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的診斷標(biāo)志物和潛在的個(gè)性化臨床治療靶點(diǎn)，為臨床探索新的肝癌治療方案指明了一個(gè)新方向。
　　第二部分:轉(zhuǎn)錄組和基因組整合分析鑒定二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH在肝癌惡性進(jìn)展的作用及機(jī)制研究
　　研究背景和目的:
　　肝細(xì)胞癌(primary liver cancer)是世界上第四位最常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)，隨著影像診斷學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的不斷進(jìn)步，在肝癌的發(fā)病機(jī)理、診斷及治療上，都取得了極

16、大的進(jìn)步，但是大多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)到了中晚期，失去了最佳的手術(shù)機(jī)會(huì)，常規(guī)放化療不敏感，且術(shù)后經(jīng)常出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，肝癌患者預(yù)后仍然相當(dāng)差、病死率極高，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。在2015年，中國(guó)大約有47萬(wàn)新發(fā)現(xiàn)的肝癌病例，并有42萬(wàn)左右的病例死于肝癌。肝癌的診療形勢(shì)仍然相當(dāng)嚴(yán)峻，因此，闡明肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找行之有效的預(yù)后診斷標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)仍然是肝癌研究的重要方面，對(duì)提高肝癌的診療效果和預(yù)后具有關(guān)鍵意義。
　　代謝組學(xué)是繼蛋白質(zhì)

17、組學(xué)和基因組學(xué)之后新近發(fā)展起來(lái)的一門(mén)學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)分別從蛋白質(zhì)和基因?qū)用嫣綄ど幕顒?dòng)，而實(shí)際上細(xì)胞內(nèi)許多生命活動(dòng)是與代謝相關(guān)的，如細(xì)胞信號(hào)(cell signaling)，能量傳遞等都是受代謝調(diào)控的。有人認(rèn)為，蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)能夠說(shuō)明可能發(fā)生的事件，而代謝組學(xué)則反映確實(shí)已經(jīng)發(fā)生了的事情。代謝組學(xué)的研究主要集中在已知代謝通路相關(guān)調(diào)節(jié)酶和基因，完成其在疾病發(fā)生發(fā)展等方面的研究。因此，為更全面的尋

18、找新的代謝相關(guān)的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，我們通過(guò)對(duì)50例肝癌病人的癌和癌旁組織樣本進(jìn)行RNA測(cè)序（14例高轉(zhuǎn)移樣本，13例低轉(zhuǎn)移樣本），通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和基因組生物信息學(xué)整合分析，鑒定了癌-癌旁樣本，高轉(zhuǎn)移-低轉(zhuǎn)移樣本中差異表達(dá)的基因，以及體細(xì)胞突變，和代謝通路相關(guān)酶的富集情況。在我們鑒定出的關(guān)鍵代謝酶中，發(fā)現(xiàn)二甲基甘氨酸脫氫酶(dimethylglycine dehydrogenase，DMGDH)具有良好的區(qū)分癌和癌旁的能力，是重要的診斷和預(yù)后

19、相關(guān)因子。
　　本研究旨在深入探討二甲基甘氨酸脫氫酶(DMGDH)在肝癌惡性進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮的重要作用及可能的分子機(jī)制，為肝癌的精準(zhǔn)治療提供新的潛在靶點(diǎn)。
　　研究方法:
　　1.收集肝癌病人的癌和癌旁組織樣本，進(jìn)行RNA測(cè)序，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，包括體細(xì)胞突變、癌-癌旁組織差異基因、高轉(zhuǎn)移-低轉(zhuǎn)移組織差異基因等，篩選目標(biāo)分子;
　　2.利用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH在肝癌患者癌

20、和癌旁樣本轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)豐度;
　　3.利用Westem blot手段和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH在肝癌患者癌和癌旁組織中蛋白水平的表達(dá)情況;
　　4.繪制receiving operating curve(ROC)曲線(xiàn)，計(jì)算area under curve(AUC)，評(píng)估二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH在肝癌病人中的臨床診斷價(jià)值;
　　5.收集整理上述肝癌病人臨床相關(guān)病理信息和預(yù)后隨訪資料，同時(shí)挖掘

21、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，統(tǒng)計(jì)分析二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性，以及對(duì)肝癌病人的總體生存和術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值;
　　6.利用質(zhì)粒過(guò)表達(dá)技術(shù)調(diào)節(jié)二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH的表達(dá)水平觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響;
　　7.利用質(zhì)粒過(guò)表達(dá)技術(shù)以及siRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)調(diào)節(jié)二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH的表達(dá)水平，通過(guò)transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)、Matrigel小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察高低表達(dá)二甲基甘氨酸脫氫酶D

22、MGDH對(duì)肝癌細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響;
　　8.利用裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型，研究過(guò)表達(dá)DMGDH對(duì)肝癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響;
　　9.利用表達(dá)譜芯片測(cè)序技術(shù)、Western blot技術(shù)，結(jié)合細(xì)胞因子刺激實(shí)驗(yàn)，研究DMGDH對(duì)Akt信號(hào)通路的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.在肝癌臨床樣本中，二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均顯著低于癌旁組織，計(jì)算AUC提示具有臨床診斷價(jià)值;
　　2.在

23、所檢測(cè)的RT-PCR樣本、RNA測(cè)序樣本以及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH低表達(dá)能夠預(yù)測(cè)更具侵襲特點(diǎn)的臨床病理特征和肝癌患者術(shù)后更高的復(fù)發(fā)率，具有一定的預(yù)后診斷價(jià)值;
　　3.過(guò)表達(dá)DMGDH并不顯著影響肝癌細(xì)胞的增殖能力;
　　4.體外實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)DMGDH能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力;干擾DMGDH則能夠顯著提高肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力;
　　5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提示，在尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型中，過(guò)表

24、達(dá)二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力;
　　6.二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH可能通過(guò)抑制Akt相關(guān)信號(hào)通路而影響肝癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展。
　　結(jié)論:
　　本研究首先從臨床肝癌病人的癌和癌旁組織樣本入手，通過(guò)RNA測(cè)序技術(shù)，結(jié)合代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄組和基因組整合分析，篩選出二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH，并分析DMGDH在肝癌患者組織樣本中的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)DMGDH的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平都明顯低于癌

25、旁組織，在轉(zhuǎn)移能力更高的癌栓組織中表達(dá)水平更低。臨床相關(guān)性分析顯示，組織中DMGDH的表達(dá)水平越低，癌栓發(fā)生率越高，甲胎蛋白AFP含量越高，且具有更高的肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率;隨后通過(guò)質(zhì)粒過(guò)表達(dá)及siRNA介導(dǎo)的基因沉默干擾技術(shù)，研究DMGDH對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響;并進(jìn)而闡明DMGDH調(diào)控肝癌細(xì)胞生物學(xué)功能可能的相關(guān)信號(hào)通路機(jī)制。我們的數(shù)據(jù)顯示DMGDH主要是通過(guò)抑制Akt信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移，提示Akt信號(hào)通路在DMGDH