多組學整合在肝癌惡性進展研究中的應用與相關(guān)分子機制探討.pdf

1、第一部分:轉(zhuǎn)錄組和蛋白組整合分析鑒定乙醛脫氫酶2 ALDH2在肝癌惡性進展的作用及機制研究
　　研究背景和目的:
　　原發(fā)性肝癌是最常見的肝臟惡性腫瘤，也是中國最常見最致命的的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在惡性腫瘤中居第四位，而死亡率則位居腫瘤相關(guān)死亡的第三位，且是60歲以下男性中最常見和死亡率最高的腫瘤，居肝硬化病人相關(guān)死亡原因的首位。對于早期診斷的肝臟腫瘤病人，可以通過肝臟切除術(shù)、射頻消融術(shù)、動脈化療栓塞和肝移植，獲得較好的治

2、療效果。但是大部分肝臟腫瘤病人初次確診時即為晚期，由于大血管癌栓、包膜不完整、子灶和腫瘤多發(fā)等情況的存在，手術(shù)后仍然有相當高的復發(fā)率轉(zhuǎn)移率，預后結(jié)果不理想，我國的肝癌診療形勢依然相當嚴峻，早期診斷困難、復發(fā)轉(zhuǎn)移率高、治療手段少以及個性化治療缺乏等仍然是肝癌診療工作中面臨的主要問題。因此，急需探索新的診療方法，鑒定新的特異的肝癌進展分子標記，以建立更全面更有效的分子分型分層系統(tǒng)，并深入探討肝癌切除術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機制，這對于選擇行之

3、有效的治療方式，減少肝癌切除術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移，提高患者的生存質(zhì)量，延長患者的生存期至關(guān)重要。
　　整合多個層次的組學數(shù)據(jù)，是全面而系統(tǒng)認識和研究肝細胞癌的一個重要方向。包括TCGA(The Cancer Genome Atlas)在內(nèi)的多個國內(nèi)和國際的研究項目為數(shù)據(jù)的整合提供了重要的資源，但是怎樣整合多個組學的數(shù)據(jù)依然是困擾著肝癌研究的一個難題。其中，通過將多個組學的數(shù)據(jù)進行累加，尋找他們之間的共性，是目前使用的一種比較簡單的數(shù)據(jù)整合

4、方式。我們利用50例肝癌患者癌和癌旁的組織樣本進行RNA測序（14例高轉(zhuǎn)移樣本，13例低轉(zhuǎn)移樣本），對高轉(zhuǎn)移和低轉(zhuǎn)移的混合樣本進行蛋白質(zhì)組測序，通過整合分析，尋找到了在肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中表達變化頻率比較高的酶，乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase-2，ALDH2）。
　　乙醛脫氫酶2 ALDH2，是醛脫氫酶的一種，負責催化乙醛氧化為乙酸的反應。在正常的生理狀態(tài)下，肝中的乙醇脫氫酶負責將乙醇（酒的成分）氧化為乙

5、醛，生成的乙醛作為底物進一步在乙醛脫氫酶2 ALDH2的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的乙酸，進而分解成二氧化碳CO2和水H2O排出體外，從而使乙醛脫氫酶2 ALDH2扮演著重要的抗氧化應激分子角色，減少了乙醛的細胞毒性。以往的研究揭示，在病理狀態(tài)下，由于乙醛脫氫酶2 ALDH2活性的降低或喪失，導致其催化乙醛的能力減弱，大量的乙醛在體內(nèi)堆積引起了一系列的病理生理反應，造成飲酒后出現(xiàn)面部潮紅、心跳加速等臉面潮紅綜合征現(xiàn)象，并可作為獨立因素和飲酒與食管

6、癌高風險密切相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)使臉面潮紅綜合征、飲酒和腫瘤的發(fā)病風險研究受到關(guān)注，但由于腫瘤的類型不同、患病人群各異，研究結(jié)果不盡一致。那么，在肝癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移復發(fā)過程中，乙醛脫氫酶2 ALDH2的表達情況如何，發(fā)揮著什么樣的作用，以及如何發(fā)揮作用，尚未見報道。
　　研究方法:
　　1.收集相關(guān)臨床肝癌患者樣本，進行RNA和蛋白質(zhì)組測序，經(jīng)過生物信息學關(guān)聯(lián)分析，篩選目標分子;
　　2.收集臨床肝癌樣本，經(jīng)real-time

7、PCR、Western blot、免疫組織化學技術(shù)檢測乙醛脫氫酶2 ALDH2在肝癌組織中mRNA水平、蛋白水平的表達情況;
　　3.收集整理上述肝癌患者臨床病理信息和隨訪預后資料，同時挖掘TCGA公用數(shù)據(jù)庫，進行統(tǒng)計分析和預后分析，探討ALDH2表達與臨床病理特點的相關(guān)性，繪制receiving operating curve(ROC)曲線，計算area under curve(AUC)，評估乙醛脫氫酶2 ALDH2在肝癌病人中

8、的臨床診斷價值，以及對肝癌患者的總體生存和術(shù)后復發(fā)的預測價值;
　　4.利用慢病毒系統(tǒng)建立ALDH2過表達細胞系和siRNA介導的基因沉默技術(shù)調(diào)節(jié)ALDH2的表達，采用cell counting kit-8(CCK8)實驗、劃痕實驗、transwell小室遷移實驗、Matrigel穿膜侵襲實驗觀察高低表達ALDH2對肝癌細胞體外增殖、遷移和侵襲能力的影響;同時利用酶活性檢測技術(shù)、基因位點定點突變技術(shù)，檢測對ALDH2酶活性、蛋白表

9、達量以及對肝癌細胞遷移功能的影響;
　　5.利用裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型及脾靜脈注射肝轉(zhuǎn)移模型，研究過表達ALDH2對肝癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響;
　　6.利用real-time PCR、Western blot技術(shù)，結(jié)合表達譜芯片測序技術(shù)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，研究ALDH2對AMPK等信號通路的影響;
　　7.利用Western blot技術(shù)，結(jié)合激活劑實驗、抑制劑實驗和siRNA介導的基因沉默技術(shù)調(diào)節(jié)ALDH2的表達，研

10、究ALDH2與AMPK的關(guān)系及對其功能的影響;同時利用乙醛靶向檢測技術(shù)研究ALDH2對乙醛催化的作用，利用外源性添加乙醛的方法探討其對肝癌細胞遷移功能的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.RNA測序和蛋白質(zhì)組測序整合分析提示，肝癌臨床樣本中乙醛脫氫酶2ALDH2在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均較癌旁組織顯著降低;
　　2.在擴大肝癌臨床樣本中，乙醛脫氫酶2 ALDH2在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著低于癌旁組織，在轉(zhuǎn)移能力較高的組織中表達

11、水平更低;在檢測的5種肝癌細胞系中，細胞系轉(zhuǎn)移能力越強，乙醛脫氫酶2 ALDH2的蛋白表達水平越低;
　　3.在TCGA數(shù)據(jù)庫和所檢測的臨床樣本中，乙醛脫氫酶2 ALDH2低表達可以提示更具侵襲特點的臨床病理特性和肝癌患者更差的預后，且具有一定的診斷價值;
　　4.體外實驗提示，過表達乙醛脫氫酶2 ALDH2能夠有效抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力;干擾乙醛脫氫酶2 ALDH2則能夠明顯提高肝癌細胞的遷移和侵襲能力;過表達乙醛脫

12、氫酶2 ALDH2主要是通過提高ALDH2的酶活性而發(fā)揮作用;
　　5，體內(nèi)實驗提示，在尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型和脾靜脈注射肝轉(zhuǎn)移模型中，過表達乙醛脫氫酶2 ALDH2能夠顯著抑制肝癌細胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力;
　　6.過表達乙醛脫氫酶2 ALDH2可以活化AMPK相關(guān)的信號通路，與調(diào)控肝癌細胞的轉(zhuǎn)移能力有關(guān);
　　7.激活劑實驗、抑制劑實驗和siRNA介導的基因沉默技術(shù)調(diào)節(jié)AMPK表達實驗提示，乙醛脫氫酶2 ALDH2通過活化AM

13、PK相關(guān)信號通路而影響肝癌細胞的惡性進展，且與影響細胞內(nèi)的氧化還原水平有關(guān);同時過表達乙醛脫氫酶2 ALDH2可影響細胞內(nèi)的乙醛水平而影響肝癌細胞的惡性進展。
　　結(jié)論:
　　本研究工作發(fā)現(xiàn)，在肝細胞癌中乙醛脫氫酶2 ALDH2表達水平在癌中較癌旁明顯降低，在轉(zhuǎn)移能力較高的肝癌組織中表達水平更低，通過大樣本肝癌患者組織驗證，我們發(fā)現(xiàn)這種低表達與肝癌的惡性臨床病理指標具有明顯的相關(guān)性，單因素和多因素分析進一步揭示乙醛脫氫酶2

14、ALDH2是獨立的術(shù)后預后風險因素，且具有一定的臨床診斷價值。體外和體內(nèi)的實驗進一步證明過表達乙醛脫氫酶2 ALDH2可以有效的抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力，并且這種能力主要是通過活化AMPK相關(guān)的信號通路實現(xiàn)的。我們首次報道了與肝癌惡性進展相關(guān)的乙醛脫氫酶2 ALDH2和AMPK信號通路的相互作用，這種相互作用可能是通過乙醛脫氫酶2 ALDH2影響細胞內(nèi)的氧化還原水平實現(xiàn)的。綜上所述，乙醛脫氫酶2 ALDH2在肝癌的惡性進展中起到了重

15、要的作用，可能是肝細胞癌轉(zhuǎn)移復發(fā)的診斷標志物和潛在的個性化臨床治療靶點，為臨床探索新的肝癌治療方案指明了一個新方向。
　　第二部分:轉(zhuǎn)錄組和基因組整合分析鑒定二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH在肝癌惡性進展的作用及機制研究
　　研究背景和目的:
　　肝細胞癌(primary liver cancer)是世界上第四位最常見的惡性腫瘤，近年來，隨著影像診斷學、分子生物學等學科的不斷進步，在肝癌的發(fā)病機理、診斷及治療上，都取得了極

16、大的進步，但是大多數(shù)患者在確診時已經(jīng)到了中晚期，失去了最佳的手術(shù)機會，常規(guī)放化療不敏感，且術(shù)后經(jīng)常出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移，肝癌患者預后仍然相當差、病死率極高，嚴重威脅人類健康。在2015年，中國大約有47萬新發(fā)現(xiàn)的肝癌病例，并有42萬左右的病例死于肝癌。肝癌的診療形勢仍然相當嚴峻，因此，闡明肝癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找行之有效的預后診斷標志物和干預靶點仍然是肝癌研究的重要方面，對提高肝癌的診療效果和預后具有關(guān)鍵意義。
　　代謝組學是繼蛋白質(zhì)

17、組學和基因組學之后新近發(fā)展起來的一門學科，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分。蛋白質(zhì)組學和基因組學分別從蛋白質(zhì)和基因?qū)用嫣綄ど幕顒樱鴮嶋H上細胞內(nèi)許多生命活動是與代謝相關(guān)的，如細胞信號(cell signaling)，能量傳遞等都是受代謝調(diào)控的。有人認為，蛋白質(zhì)組學和基因組學能夠說明可能發(fā)生的事件，而代謝組學則反映確實已經(jīng)發(fā)生了的事情。代謝組學的研究主要集中在已知代謝通路相關(guān)調(diào)節(jié)酶和基因，完成其在疾病發(fā)生發(fā)展等方面的研究。因此，為更全面的尋

18、找新的代謝相關(guān)的診斷和預后標志物，我們通過對50例肝癌病人的癌和癌旁組織樣本進行RNA測序（14例高轉(zhuǎn)移樣本，13例低轉(zhuǎn)移樣本），通過轉(zhuǎn)錄組和基因組生物信息學整合分析，鑒定了癌-癌旁樣本，高轉(zhuǎn)移-低轉(zhuǎn)移樣本中差異表達的基因，以及體細胞突變，和代謝通路相關(guān)酶的富集情況。在我們鑒定出的關(guān)鍵代謝酶中，發(fā)現(xiàn)二甲基甘氨酸脫氫酶(dimethylglycine dehydrogenase，DMGDH)具有良好的區(qū)分癌和癌旁的能力，是重要的診斷和預后

19、相關(guān)因子。
　　本研究旨在深入探討二甲基甘氨酸脫氫酶(DMGDH)在肝癌惡性進展過程中發(fā)揮的重要作用及可能的分子機制，為肝癌的精準治療提供新的潛在靶點。
　　研究方法:
　　1.收集肝癌病人的癌和癌旁組織樣本，進行RNA測序，經(jīng)過生物信息學分析，包括體細胞突變、癌-癌旁組織差異基因、高轉(zhuǎn)移-低轉(zhuǎn)移組織差異基因等，篩選目標分子;
　　2.利用real-time PCR技術(shù)檢測二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH在肝癌患者癌

20、和癌旁樣本轉(zhuǎn)錄水平的表達豐度;
　　3.利用Westem blot手段和免疫組織化學方法檢測二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH在肝癌患者癌和癌旁組織中蛋白水平的表達情況;
　　4.繪制receiving operating curve(ROC)曲線，計算area under curve(AUC)，評估二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH在肝癌病人中的臨床診斷價值;
　　5.收集整理上述肝癌病人臨床相關(guān)病理信息和預后隨訪資料，同時挖掘

21、TCGA數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)計分析二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH表達與臨床病理特點的相關(guān)性，以及對肝癌病人的總體生存和術(shù)后復發(fā)的預測價值;
　　6.利用質(zhì)粒過表達技術(shù)調(diào)節(jié)二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH的表達水平觀察其對肝癌細胞增殖能力的影響;
　　7.利用質(zhì)粒過表達技術(shù)以及siRNA介導的基因沉默技術(shù)調(diào)節(jié)二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH的表達水平，通過transwell小室遷移實驗、Matrigel小室侵襲實驗觀察高低表達二甲基甘氨酸脫氫酶D

22、MGDH對肝癌細胞遷移與侵襲能力的影響;
　　8.利用裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型，研究過表達DMGDH對肝癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響;
　　9.利用表達譜芯片測序技術(shù)、Western blot技術(shù)，結(jié)合細胞因子刺激實驗，研究DMGDH對Akt信號通路的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.在肝癌臨床樣本中，二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均顯著低于癌旁組織，計算AUC提示具有臨床診斷價值;
　　2.在

23、所檢測的RT-PCR樣本、RNA測序樣本以及TCGA數(shù)據(jù)庫中，二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH低表達能夠預測更具侵襲特點的臨床病理特征和肝癌患者術(shù)后更高的復發(fā)率，具有一定的預后診斷價值;
　　3.過表達DMGDH并不顯著影響肝癌細胞的增殖能力;
　　4.體外實驗表明，過表達DMGDH能夠明顯抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力;干擾DMGDH則能夠顯著提高肝癌細胞的遷移和侵襲能力;
　　5.體內(nèi)實驗提示，在尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型中，過表

24、達二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH能夠有效抑制肝癌細胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力;
　　6.二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH可能通過抑制Akt相關(guān)信號通路而影響肝癌細胞的惡性進展。
　　結(jié)論:
　　本研究首先從臨床肝癌病人的癌和癌旁組織樣本入手，通過RNA測序技術(shù)，結(jié)合代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄組和基因組整合分析，篩選出二甲基甘氨酸脫氫酶DMGDH，并分析DMGDH在肝癌患者組織樣本中的表達情況。我們發(fā)現(xiàn)DMGDH的表達在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平都明顯低于癌

25、旁組織，在轉(zhuǎn)移能力更高的癌栓組織中表達水平更低。臨床相關(guān)性分析顯示，組織中DMGDH的表達水平越低，癌栓發(fā)生率越高，甲胎蛋白AFP含量越高，且具有更高的肝癌術(shù)后復發(fā)率;隨后通過質(zhì)粒過表達及siRNA介導的基因沉默干擾技術(shù)，研究DMGDH對肝癌細胞生物學功能的影響;并進而闡明DMGDH調(diào)控肝癌細胞生物學功能可能的相關(guān)信號通路機制。我們的數(shù)據(jù)顯示DMGDH主要是通過抑制Akt信號通路抑制肝癌細胞發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移，提示Akt信號通路在DMGDH