一組蛋白降解相關(guān)分子在肝癌進(jìn)展中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 原發(fā)性肝癌是發(fā)生在肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞的一種惡性程度高、進(jìn)展快、預(yù)后差的惡性腫瘤，其發(fā)病率在惡性腫瘤中排名第六，死亡率居第三。全世界半數(shù)左右的肝癌病人集中在中國(guó)，嚴(yán)重危害我國(guó)人民的健康。
　　 近年來(lái)，通過(guò)高通量蛋白芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，在新的肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)標(biāo)志物的研究方面已經(jīng)有較大的進(jìn)展。建立肝癌轉(zhuǎn)移的多分子預(yù)測(cè)模型，經(jīng)大量臨床標(biāo)本進(jìn)一步驗(yàn)證，尤其是前瞻性規(guī)?；?yàn)證和加速臨床應(yīng)用將是今后的主要趨

2、勢(shì)和研究重點(diǎn)，對(duì)改善預(yù)后具有非常重要的臨床意義。
　　 真核細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)主要有兩種降解途徑：泛素一蛋白酶體途徑和溶酶體途徑。其中，泛素-蛋白酶體途徑能夠高選擇性地降解那些細(xì)胞在應(yīng)激和非應(yīng)激條件下產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，對(duì)維持細(xì)胞正常生理功能具有十分重要的意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，泛素化與去泛素化的改變和多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，惡性腫瘤多伴隨癌基因和抑癌基因產(chǎn)物的表達(dá)異常。
　　 基于上述研究背景，我們推測(cè)蛋白降解系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子，可能

3、通過(guò)直接影響與某些癌基因表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)水平，在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，從而具有作為肝癌預(yù)后及治療靶標(biāo)的價(jià)值。我們與美國(guó)的合作實(shí)驗(yàn)室利用基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)了70例肝癌患者癌和癌旁組織，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，我們篩選出了一組與蛋白降解相關(guān)的在肝癌中異常表達(dá)的基因：PSMD4、UBD和CSTB，并計(jì)劃深入研究它們的生物學(xué)功能。
　　 PSMD4基因編碼的蛋白是人26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基4(26S proteasomen on-

4、ATPase regulatory subunit 4)，該分子含有兩段15個(gè)氨基酸的泛素相互作用模序(UIM)，能夠選擇性結(jié)合泛素化蛋白，介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解。已有研究報(bào)道，PSMD4異常表達(dá)與炎癥性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎等疾病相關(guān)，PSMD4在肝癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能尚不十分清楚，與肝癌患者的預(yù)后關(guān)系也未見報(bào)道。國(guó)外科研機(jī)構(gòu)和本實(shí)驗(yàn)室的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與PSMD4同屬人26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基的PSMD10,又稱癌基因p28GANK

5、，其編碼的蛋白Gankyrin與肝癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，PSMD4是否也像Gankyrin一樣在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，兩者之間是否有類似之處，值得我們深入研究。
　　 泛素樣蛋白D(UbiquitinD，UBD)屬于泛素樣蛋白家族，能夠共價(jià)結(jié)合靶蛋白，使其經(jīng)蛋白酶體降解。UBD能夠通過(guò)降解IκBα，調(diào)節(jié)TNF-α或者LPS誘導(dǎo)的內(nèi)在免疫激活，并且可能參與了DC細(xì)胞的成熟過(guò)程，故以往研究局限于其在免疫系統(tǒng)中的作用。UBD在肝癌

6、中的表達(dá)情況及其在肝癌發(fā)展進(jìn)程中的具體功能并不清楚，其與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系也未見報(bào)道。
　　 CystatinB簡(jiǎn)稱CSTB，是半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一員，可以抑制包括半胱氨酸蛋白酶在內(nèi)的多種蛋白水解酶的活性。M.J.Lee等人利用基因芯片鑒定了248個(gè)基因在HCC和癌旁組織中的差異表達(dá)，運(yùn)用Northernblot以及Real-timePCR證實(shí)，在45例HCC樣本中，有36例(80％)患者CSTB的水平在癌中明顯高于癌

7、旁。更為重要的是，血清中CSTB的水平在HCC患者中明顯高于非惡性慢性肝病患者。這些結(jié)果提示，CSTB聯(lián)合AFP可能作為更敏感的HCC分子診斷標(biāo)志物。然而，CSTB在肝癌中的表達(dá)情況及在肝癌中的生物學(xué)作用尚不十分清楚，與肝癌患者預(yù)后也有待進(jìn)一步研究。
　　 本課題旨在檢測(cè)PSMD4/UBD/CSTB在肝癌中的表達(dá)，研究其在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用，利用臨床隨訪資料分析PSMD4/UBD/CSTB在肝癌預(yù)后判斷中的應(yīng)用前景，探討其作

8、為治療靶點(diǎn)的可行性，為后續(xù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 1.基因表達(dá)譜芯片篩選與確認(rèn)待研基因；
　　 2.利用Real-timePCR和Westernblot分別檢測(cè)不同肝癌細(xì)胞系/肝癌病人中PSMD4/UBD/CSTB的mRNA水平和蛋白水平；運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色在人的組織切片和肝癌組織芯片中進(jìn)一步驗(yàn)證PSMD4/UBD/CSTB表達(dá)情況；
　　 3.對(duì)103例肝癌組織預(yù)后芯片行PSM

9、D4/UBD/CSTB免疫組化染色，并對(duì)染色情況進(jìn)行評(píng)分，結(jié)合臨床病理預(yù)后資料，統(tǒng)計(jì)分析PSMD4/UBD/CSTB作為肝癌預(yù)后及治療靶標(biāo)的價(jià)值；
　　 4.構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，包裝慢病毒，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和建立穩(wěn)定細(xì)胞系，初步探討PSMD4/UBD/CSTB在肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的作用；
　　 具體包括：利用CCK8試劑測(cè)定細(xì)胞增殖情況；利用transwell檢測(cè)肝癌細(xì)胞遷移能力的變化；用Spheroid成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)肝

10、癌干細(xì)胞表型的變化；利用常規(guī)化療藥物5-氟尿嘧啶，用AnnexinVKit流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.本科室前期研究中利用基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)了70例肝癌患者癌與癌旁組織中基因的表達(dá)差異，篩選出了三個(gè)在肝癌中異常表達(dá)的基因：PSMD4、UBD和CSTB；
　　 2.PSMD4/UBD/CSTB在肝癌臨床樣本中mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均是癌中高于癌旁；
　　 3.PSMD4/UBD

11、/CSTB在肝癌組織中的表達(dá)與肝癌病人的無(wú)瘤生存期和總體生存期有關(guān)，可以作為肝癌預(yù)后指標(biāo)；
　　 4.PSMD4和UBD均能促進(jìn)細(xì)胞增殖，并能顯著抑制細(xì)胞凋亡；而CSTB可能更多地影響細(xì)胞的增殖能力，對(duì)抑制凋亡不起作用；
　　 5.PSMD4促進(jìn)肝癌細(xì)胞的自我更新能力和轉(zhuǎn)移潛能；
　　 6.PSMD4在正常組織中不表達(dá)或表達(dá)很低以及其在多種腫瘤中高表達(dá)，提示PSMD4在腫瘤治療中的應(yīng)用前景。
　　 結(jié)論：

12、
　　 本課題利用基因表達(dá)譜芯片篩選出一組在肝癌中異常表達(dá)的與蛋白質(zhì)降解相關(guān)的基因PSMD4/UBD/CSTB，高通量檢測(cè)PSMD4/UBD/CSTB在肝癌中的表達(dá)并利用大樣本驗(yàn)證；聯(lián)系臨床隨訪資料分析PSMD4/UBD/CSTB作為肝癌預(yù)后靶標(biāo)的價(jià)值，初步探討了PSMD4/UBD/CSTB在在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用，并將我們的研究重點(diǎn)錨定在與Gankyrin同屬人26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基的PSMD4，深入研究PSMD4