Anti--miR-21對(duì)eNOS表達(dá)調(diào)節(jié)和血管生成的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的:前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-21反義寡核苷酸(AS-miR-21)能顯著抑制AP1和eNOS蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子AP1在AS-miR-21對(duì)eNOS的表達(dá)調(diào)節(jié)中起重要作用。進(jìn)一步研究anti-miR-21對(duì)AngⅡ刺激下內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因表達(dá)調(diào)節(jié)的分子機(jī)制及其對(duì)體外血管形成的影響。
　　1、研究anti-miR-21對(duì)AngⅡ刺激下內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因表達(dá)調(diào)節(jié)的分子機(jī)制;
　　2、探討anti-miR-21抑制AngⅡ刺

2、激下內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移的機(jī)制及其對(duì)體外血管形成的影響;
　　3、闡明內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管形成的分子機(jī)制，深入探討anti-miR-21在心血管系統(tǒng)發(fā)育和心血管疾病中的作用。
　　方法:1、檢測(cè)anti-miR-21對(duì)AngⅡ刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS和Ap1表達(dá)的影響
　　構(gòu)建anti-miR-21高表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑將anti-miR-21質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Hu

3、man umbilical vein endothelialcells，HUVECs)內(nèi)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶UVECs分為3組:對(duì)照組、AngⅡ組和anti-miR-21+AngⅡ組。采用硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞上清液的NO濃度;RT-PCR法分別檢測(cè)eNOS和AP1 mRNA表達(dá)水平、免疫組化和免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blotting）分別檢測(cè)eNOS和AP1蛋白表達(dá)情況。
　　2、檢測(cè)anti-miR-21對(duì)AngⅡ刺激下人臍

4、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管形成的影響
　　構(gòu)建anti-miR-21高表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑將anti-miR-21質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)內(nèi)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶UVECs分為3組:對(duì)照組、AngⅡ組和anti-miR-21+AngⅡ組。觀測(cè)HUVECs的增殖（四甲基偶氮唑鹽，MTT法）、遷移（細(xì)胞劃痕

5、實(shí)驗(yàn)）、凋亡（流式細(xì)胞術(shù)）和血管形成（人工基底膜，Matrigel法）等生物學(xué)行為的改變。
　　3、檢測(cè)anti-miR-21對(duì)AngⅡ刺激下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管形成的分子機(jī)制
　　構(gòu)建anti-miR-21高表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑將anti-miR-21質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)內(nèi)，根

6、據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶UVECs分為3組:對(duì)照組、AngⅡ組和anti-miR-21+AngⅡ組。采用PCR法檢測(cè)經(jīng)AngⅡ刺激后miR-21的表達(dá)情況;采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)CD31和VEGFR2蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:1、與對(duì)照組比較，AngⅡ組HUVECs的AP1與eNOS mRNA和蛋白表達(dá)均增加(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染anti-miR-21對(duì)其mRNA和蛋白表達(dá)都起到抑制作用(P＜0.05)。
　　2、與對(duì)照組比較，A

7、ngⅡ組細(xì)胞增殖明顯上升(P＜0.05)，遷移數(shù)目上升(P＜0.05)，凋亡率下降(P＜0.05)，形成管腔能力增強(qiáng)，而轉(zhuǎn)染anti-miR-21均可對(duì)上述生物學(xué)行為起到抑制作用。
　　3、與對(duì)照組比較，AngⅡ刺激6h組和刺激24h組的miR-21 mRNA表達(dá)量均升高(P＜0.01)，但隨著刺激時(shí)間的增長(zhǎng)，miR-21 mRNA表達(dá)量有所下降(P＜0.01);AngⅡ組HUVECs的CD31與VEGFR2蛋白表達(dá)均增加(P＜0

8、.05)，而轉(zhuǎn)染anti-miR-21對(duì)其蛋白表達(dá)都起到抑制作用(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1、Anti-miR-21明顯抑制AngⅡ刺激下HUVECs eNOS的表達(dá);轉(zhuǎn)錄因子AP1的參與可能是這一調(diào)節(jié)過(guò)程的重要分子機(jī)制之一。
　　2、Anti-miR-21明顯抑制AngⅡ刺激下HUVECs的增殖、遷移、凋亡和血管形成能力，并且與其調(diào)控eNOS的表達(dá)有關(guān)。
　　3、miR-21可能作為一個(gè)重要因子參與AngⅡ?qū)?nèi)皮