27nt--miRNA對eNOS表達(dá)-活性調(diào)節(jié)及NO生成、血管新生的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的:本課題組前期研究顯示，27nt-miRNA由內(nèi)皮型NOS(eNOS)的第4內(nèi)含子27堿基重復(fù)序列產(chǎn)生，并負(fù)性調(diào)控eNOS的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平。本研究進(jìn)一步探討27nt-miRNA對eNOS表達(dá)、活性的調(diào)節(jié)及代謝產(chǎn)物NO的生成、血管新生的影響及相關(guān)分子機(jī)制研究:1）研究27nt-miRNA對血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS基因表達(dá)的調(diào)節(jié)及其相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制;2）明確27nt-miRNA對血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性及其代謝產(chǎn)物NO生成的影響及其

2、分子機(jī)制;3）闡明27nt-miRNA對細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成的影響及其相關(guān)分子機(jī)制，為分子水平治療心血管疾病提供理論依據(jù)。
　　方法:1）構(gòu)建27nt-miRNA野生型與突變型基因序列的高表達(dá)質(zhì)粒，使用X-treme GENE HP DNA脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)所染的質(zhì)粒將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)分為:空白質(zhì)粒對照組（Control group

3、）、野生型27-nt-miRNA質(zhì)粒組(Wt-27-nt-miRNA組)和突變型27-nt-miRNA質(zhì)粒組（Mut-27-nt-miRNA組）。2）檢測27nt-miRNA對eNOS基因表達(dá)的影響:將空白質(zhì)粒、Wt-27-nt-miRNA質(zhì)粒和Mut-27-nt-miRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HUVECs。應(yīng)用RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測eNOS mRNA和核轉(zhuǎn)錄因子AP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的改變;應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)（Immunocytochemi

4、stry）和免疫印跡實(shí)驗(yàn)(westernblotting)檢測eNOS蛋白和核轉(zhuǎn)錄因子AP-1蛋白表達(dá)水平的改變。3）檢測27nt-miRNA對eNOS活性及其代謝產(chǎn)物NO生成的影響:將空白質(zhì)粒、Wt-27-nt-miRNA質(zhì)粒和Mut-27-nt-miRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HUVECs。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法(EHSA)測定不同時間細(xì)胞培養(yǎng)液中eNOS活性的變化;應(yīng)用硝酸還原法測定不同時間細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO生成的變化。4）檢測27nt-m

5、iRNA對HUVECs增殖的影響:將空白質(zhì)粒、Wt-27-nt-miRNA質(zhì)粒和Mut-27-nt-miRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HUVECs。細(xì)胞轉(zhuǎn)染消化后接種于96孔板，并于24、48和72 h三個時間點(diǎn)，采用MTT法檢測各實(shí)驗(yàn)HUVECs的增殖能力。5）檢測27nt-miRNA對HUVECs遷移和管腔形成的影響:將空白質(zhì)粒、Wt-27-nt-miRNA質(zhì)粒和Mut-27-nt-miRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HUVECs。細(xì)胞轉(zhuǎn)染消化后接種于96孔板，

6、采用劃痕試驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的遷移能力;采用人工基底膜(Matrigel)檢測各組細(xì)胞的管腔形成能力。
　　結(jié)果:1）與對照組比較，27nt-miRNA高表達(dá)組eNOS mRNA和AP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯降低（P＜0.05），eNOS和AP-1蛋白表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。2)與對照組比較，27nt-miRNA高表達(dá)組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中eNOS活性明顯減弱（P＜0.05）及其代謝產(chǎn)物NO生成明顯減少(P＜0.05)。3)與對照

7、組比較，27nt-miRNA高表達(dá)組的細(xì)胞增殖能力明顯降低(P＜0.05)，遷移能力明顯下降(P＜0.05)，血管新生面積比率也明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1）27nt-miRNA顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，顯著抑制核轉(zhuǎn)錄因子AP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，AP-1的參與可能是這一調(diào)節(jié)過程的重要分子機(jī)制之一。2）27nt-miRNA顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性及其代謝產(chǎn)物NO的生成，并且可