丹參和仙鶴草抑制A549細胞增殖及對血管生成相關(guān)基因表達的影響.pdf

1、我國惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢，2008年全國第三次死因回顧抽樣調(diào)查結(jié)果表明，惡性腫瘤是我國居民的第二大死亡原因[1]。對于腫瘤的治療，臨床上放、化療、手術(shù)治療是主要治療手段，其中手術(shù)切除腫瘤是目前根治癌癥的主要方法，但一般僅適用于癌癥早中期及無并發(fā)癥患者，其適應(yīng)范圍有限。對于失去手術(shù)治療機會及中晚期腫瘤轉(zhuǎn)移的患者，放、化療治療十分重要，但仍存在敏感性低的問題，且對人體有較大的毒副作用。要彌補西醫(yī)治療存在的缺陷，輔以中藥治療

2、是切實可行的。目前國內(nèi)腫瘤臨床治療中，中藥主要用于配合放化療增效減毒、預(yù)防復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移以及缺乏有效治療手段的中晚期腫瘤抗癌治療[2]。據(jù)資料統(tǒng)計，在我國每年新發(fā)生的癌癥病人超過100萬，采用手術(shù)治療的有10％-20％，有1/3的病人接受放療或化療，其余有超過半數(shù)的病人接受中醫(yī)藥治療、生物治療等其他療法。在接受中醫(yī)藥治療的病人中，大約有1/3（超過15萬）的病人通過治療減輕了痛苦，壽命得到延長[3]。大量的臨床資料表明，中醫(yī)藥在腫瘤治療中發(fā)

3、揮重要的作用，臨床應(yīng)用前景廣闊，但對中醫(yī)藥抗腫瘤作用的評價，現(xiàn)主要是憑借其臨床宏觀的用藥經(jīng)驗，缺乏科學(xué)的實驗數(shù)據(jù)來支撐，限制了中醫(yī)藥的臨床應(yīng)用和發(fā)展，因此對其進行深入的研究將有助于更好的發(fā)揮中醫(yī)藥在腫瘤治療中的應(yīng)用，并有效的指導(dǎo)臨床用藥。
　　 實驗?zāi)康模簩τ谂R床常用的幾大類抗腫瘤中藥中選擇六味藥作為代表進行抗腫瘤作用的初步研究；對理血類中藥（丹參、仙鶴草）的抗腫瘤作用機制進行研究；并針對理血藥對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用存在的疑問，觀察

4、活血化瘀藥丹參和收斂止血藥仙鶴草對肺腺癌A549細胞中與腫瘤血管生成相關(guān)基因VEGF、COX-2的影響，初探活血化瘀藥丹參與收斂止血藥仙鶴草是否具有影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用，以期為丹參和仙鶴草的臨床抗腫瘤應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　 實驗方法：(1)選擇丹參、川芎、羊乳、仙鶴草、半夏、附子作為代表對人肺腺癌A549細胞進行體外藥物篩選實驗；(2)根據(jù)初篩結(jié)果，用丹參水提液進行人肺癌A549細胞，人肝癌SMMC-7721細胞，人乳腺癌M

5、DA-MB-231細胞，人胃癌MGC-803細胞MTT體外篩選實驗，根據(jù)實驗結(jié)果，進一步研究丹參水提液對A549細胞的增殖抑制作用的可能機制，包括：倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、流式細胞術(shù)；(3)用仙鶴草水提液對上述四株癌細胞進行體外篩選實驗，根據(jù)實驗結(jié)果，進一步研究仙鶴草水提液對A549細胞的增殖抑制作用的可能機制，包括：倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、流式細胞術(shù)；(4)采用Real-timePCR術(shù)檢測丹參、仙鶴草用藥前后對A549細胞中與腫瘤血

6、管生成相關(guān)基因COX-2、VEGF基因的表達情況。
　　 實驗結(jié)果：(1)六味藥抗A549的腫瘤篩選實驗結(jié)果提示，丹參和仙鶴草兩味藥體外抑制腫瘤細胞增殖作用最佳；(2)丹參水提液對四株癌細胞的體外篩選實驗結(jié)果提示，丹參水提液對人肺癌A549細胞增殖抑制作用最好，呈劑量依賴性，且作用48h效果尤為顯著；倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察經(jīng)丹參水提液作用48h后A549細胞數(shù)目明顯減少，細胞皺縮，出現(xiàn)凋亡細胞；應(yīng)用流式細胞儀分析技術(shù)研究表明

7、丹參水提液可以誘導(dǎo)細胞凋亡，其抑制細胞增殖作用可能與誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)；(3)仙鶴草水提液對四株癌細胞的體外篩選實驗結(jié)果提示對人肺癌A549細胞增殖抑制作用最好，且作用48h效果尤為顯著；倒置顯微鏡可觀察到細胞的形態(tài)學(xué)改變；細胞熒光染色出現(xiàn)了明顯的凋亡細胞，表現(xiàn)為細胞皺縮、核染色質(zhì)濃縮、核碎裂等凋亡特征性的形態(tài)學(xué)改變；流式細胞儀檢測結(jié)果顯示丹參水提液可誘導(dǎo)細胞凋亡，提示其抑制細胞增殖作用可能與誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)；(4)采用Real-time

8、PCR術(shù)定量檢測丹參、仙鶴草用藥前后對A549細胞COX-2、VEGF基因表達的影響，結(jié)果提示丹參水提液作用A549細胞12h后，對COX-2、VEGF基因均具有下調(diào)作用，且呈一定的劑量依賴性：仙鶴草水提液作用于A549細胞12h后，對COX-2、VEGF基因均具有下調(diào)作用，對VEGF基因的影響呈一定的劑量依賴性；對COX-2基因的下調(diào)作用最為明顯，但對COX-2基因的影響不呈現(xiàn)劑量依賴性。這提示兩味藥均可通過下調(diào)與腫瘤血管生成相關(guān)基因

9、VEGF、COX-2基因的表達，從而在一定程度上影響非小細胞肺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，這也可能為丹參和仙鶴草水提液抑制A549細胞增殖的機制之一。
　　 本實驗結(jié)果提示丹參、川芎、羊乳、仙鶴草、半夏、附子中丹參和仙鶴草的抗A549細胞增殖作用較好；在人肺癌A549細胞，人肝癌SMMC-7721細胞，人乳腺癌MDA-MB-231細胞，人胃癌MGC-803細胞四株細胞中，丹參和仙鶴草對A549細胞的增殖抑制作用較好，且其增殖抑制的作用機制可