低氘水對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖和侵襲力抑制作用及HepG2細(xì)胞miRNAs陣列分析.pdf

1、目的：⑴比較不同氘體積濃度對(duì)人肝癌細(xì)胞株及正常肝細(xì)胞的增殖及侵襲力的影響作用。⑵以HepG2細(xì)胞為代表，檢測(cè)與分析低氘水對(duì)HepG2處理后的miRNAs差異表達(dá)譜，初步探討低氘水抗肝癌的可能機(jī)制。
　　 方法：①M(fèi)TT法檢測(cè)低氘水對(duì)肝癌HepG2、7402、SK-Hep-1和正常人肝細(xì)胞LO2增值的抑制作用;平板克隆比較不同濃度低氘水作用肝癌HepG2、7402、SK-Hep-1和正常人肝細(xì)胞LO2后形成的克隆集落數(shù)的差異;細(xì)胞

2、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低氘水對(duì)肝癌HepG2、7402、SK-Hep-1和LO2細(xì)胞侵襲遷移能力;流式細(xì)胞儀檢測(cè)低氘水對(duì)HepG2、7402、SK-Hep-1和LO2細(xì)胞周期的變化影響;ATP酶試劑盒測(cè)試低氘水對(duì)HepG2、SK-Hep-1、7402和LO2細(xì)胞的ATP酶表達(dá)變化;Western-blot檢測(cè)低氘水對(duì)HepG2、SK-Hep-1、7402和LO2細(xì)胞的cylinA、cylinE2、ATP、P21、Phospho-wee1、PCNA

3、等蛋白表達(dá)情況。②以HepG2細(xì)胞為代表，通過(guò)基因芯片分析低氘水對(duì)HepG2細(xì)胞的miRNAs表達(dá)譜;qRT-PCR驗(yàn)證低氘水對(duì)HepG2細(xì)胞的miRNAs差異表達(dá)譜;生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因及其功能;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染目的miRNAs后細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力;RT-PCR檢測(cè)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染目的miRNAs inhibit和mimics后的基因表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：⑴低氘水對(duì)肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的增殖和侵襲力影響:隨著培

4、養(yǎng)基中氘含量下降，在平板克隆、細(xì)胞劃痕和MTT實(shí)驗(yàn)中，肝癌HepG2、7402、SK-Hep-1細(xì)胞集落生成以及細(xì)胞游走侵襲能力顯著下降(P＜0.05)，但低氘水對(duì)人正常肝細(xì)胞LO2生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。⑵低氘水能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)周期阻滯:流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，各肝癌細(xì)胞經(jīng)低氘水處理后細(xì)胞G1、G2期靜止或略微增加，S期減少(P＜0.05)，而對(duì)正常肝細(xì)胞生長(zhǎng)周期無(wú)明顯抑制。⑶低氘水抑制肝癌細(xì)胞ATP酶活力:ATP酶試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示低氘水能

5、顯著抑制肝癌細(xì)胞Na+K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和T-ATP酶活力(P＜0.01）。⑷低氘水影響肝癌細(xì)胞相關(guān)周期蛋白表達(dá):western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示P21蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，clylinE2、ATP、cylinA、Phospho-wee1、PCNA等顯著下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)。⑸低氘水對(duì)肝癌細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜差異影響:Affymetrix microRNA芯片比較低氘水(50 ppm)與普通

6、水(150 ppm)處理肝細(xì)癌胞HepG2后，miRNAs表達(dá)譜差異結(jié)果顯示差異倍數(shù)在兩倍以上的miRNA有182個(gè)，其中96個(gè)高表達(dá)，86個(gè)低表達(dá);qRT-PCR驗(yàn)證低氘水對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的miRNAs差異表達(dá)譜中的hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p的表達(dá)，結(jié)果顯示hsa-mir-143(4.6025±1.214倍),hsa-mir-145-3p(3.8450±2.343倍),hsa

7、-mir-145-5p(3.20750±2.154倍)，(P＜0.05)。⑹hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p調(diào)控ABCC4和ATP11C基因的表達(dá):生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p調(diào)控的靶基因與腫瘤的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和多藥耐藥等相關(guān);miRNAs轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:ABCC4和ATP11C可能是hsa-mi

8、R-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p調(diào)控的靶基因（P＜0.01）。
　　 結(jié)論：①低氘水對(duì)人肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲力具有顯著的抑制效應(yīng)，對(duì)正常肝細(xì)胞無(wú)毒副作用。②低氘水顯著影響肝癌相關(guān)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，通過(guò)水通道和ATP酶活性等誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞G1、G2期的靜止和S期阻滯，可能是抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制之一。③低氘水顯著上調(diào)hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-m