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文檔簡介
1、目的:Twist基因在惡性腫瘤細胞上皮-間充質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)中發(fā)揮重要作用。本研究選用MDA-MB-231和4T1乳腺癌細胞系和小鼠乳腺癌肝肺轉移模型,研究Twist基因和EMT相關標志物波形蛋白(Vimentin)和E鈣粘蛋白(E-cadherin)在體內外的表達,探討水飛薊賓是否是通過影響Twist基因的表達來調控MDA-MB-231和4T1乳腺癌細胞系發(fā)生EMT,
2、進而明確其對惡性乳腺癌腫瘤侵襲轉移能力的影響。
方法:
1.體外實驗:采用具有高轉移性的MDA-MB-231和4T1細胞研究水飛薊賓對兩乳腺癌細胞EMT的影響。培養(yǎng)人乳腺癌細胞系MDA-MB-231和小鼠乳腺癌細胞系4T1,采用MTT法檢測水飛薊賓對細胞增殖能力的影響;通過細胞劃痕實驗檢測水飛薊賓對細胞遷移能力的影響,采用Transwell小室法檢測水飛薊賓對細胞遷移與侵襲能力的影響,分別采用RT-PCR與Weste
3、rn blot檢測水飛薊賓對乳腺癌細胞Twist基因與E鈣粘蛋白和波形蛋白表達水平的影響。
2.體內實驗:在BABL-c小鼠第四乳腺對接種4T1細胞建立乳腺癌肝肺轉移模型。根據(jù)腫瘤的體積分層后,將小鼠隨機分成空白對照組、水飛薊賓低劑量組(50mg/kg)、中劑量組(100mg/kg)、高劑量組(200mg/kg),每組8只。水飛薊賓經(jīng)腹腔注射,每天一次,連續(xù)兩周,空白對照組給予同等體積的生理鹽水。末次給藥的次日取腫瘤及肝、肺組
4、織,通過瘤體積與瘤重評價水飛薊賓對移植瘤生長的影響,通過肉眼觀察和常規(guī)HE染色檢測水飛薊賓對腫瘤轉移的影響,采用Western Blot檢測水飛薊賓對E鈣粘蛋白和波形蛋白表達的影響。
結果:
1.體外實驗:MTT檢測結果顯示不同濃度水飛薊賓(25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml)干預后,50-200μg/ml范圍內的水飛薊賓可以不同程度地抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231和小鼠乳腺癌細
5、胞4T1的增殖,并呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。根據(jù)MTT檢測結果,其余細胞實驗均選擇50-200μg/ml范圍內的水飛薊賓干預細胞24h進行檢測。細胞劃痕和Transwell小室法實驗結果均顯示,水飛薊賓干預后,MDA-MB-231細胞的遷移與侵襲能力均減弱,且隨藥物劑量的增大而更弱,對4T1細胞而言,劃痕實驗能表明水飛薊賓可以抑制該細胞的遷移,但是在Tranwell遷移與侵襲實驗中對照組和各用藥組的4T1細胞均不能透過Transwell的微
6、孔膜。RT-PCR檢測結果顯示,4T1細胞經(jīng)不同濃度水飛薊賓干預后,與對照組相比,Twist基因的相對表達量均降低(*p<0.05)。同樣的MDA-MB-231細胞,在藥物干預后,Twist基因的相對表達量也不同程度的降低(p<0.05),于高劑量時降低的最為顯著。Western Blot檢測結果顯示,水飛薊賓干預后,兩細胞E鈣粘蛋白相對表達量較對照組明顯上調(p<0.05),波形蛋白相對表達量顯著下調(p<0.05)。
2.
7、體內實驗結果:腹腔注射低(50mg/kg)、中(100mg/kg)、高(200mg/kg)劑量的水飛薊賓干預小鼠后,各組的平均瘤重為2.11±0.37g,1.37土0.21g和1.45±0.15g,對照組的平均瘤重為2.18±0.31g,低劑量組與對照組相比瘤重沒有差異,而中高劑量組與對照組相比瘤重有顯著性差異(p<0.05)。與對照組相比,各給藥組小鼠的瘤體積明顯變小(p<0.05),說明水飛薊賓能夠抑制4T1移植瘤的生長。水飛薊賓(
8、50mg/kg,100mg/kg,200mg/kg)干預后,肉眼觀察肝肺表面轉移的結節(jié)數(shù),藥物組肝表面結節(jié)數(shù)分別為:7.09±0.11個,4.76±0.37個,1.03±0.23個,與對照組10.81±0.15個相比,均有顯著性差異(p<0.05);而各藥物組的肺結節(jié)數(shù)分別為:9.24±0.28個,6.58±0.19個,2.21±0.13個,與對照組13.72±0.26個相比,均有顯著性差異(p<0.05);常規(guī)HE染色可看出各藥物組轉
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