SCF-E3泛素連接酶亞基RBX1在鞭毛-纖毛解聚及食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、蛋白質(zhì)的泛素化是細(xì)胞內(nèi)降解蛋白質(zhì)的主要途徑，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）降解了胞內(nèi)約80％的蛋白質(zhì)且本身具有高度的特異性。泛素化過程需要泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3的共同作用。SCF-E3泛素連接酶是E3泛素連接酶中最大的家族，在UPS中主要負(fù)責(zé)識別大量特異性靶蛋白，參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)多種生理過程，包括調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)﹑細(xì)胞周期﹑細(xì)胞凋亡﹑DNA修復(fù)等過程。目前的一些研究證

2、明蛋白酶體參與鞭毛/纖毛的解聚過程，因此我們推斷同樣參與蛋白降解的泛素連接酶可能也參與到這一過程。
　　鞭毛和纖毛在進化上十分保守并且擁有十分類似的結(jié)構(gòu)，是一種細(xì)胞基體突出于細(xì)胞表面的細(xì)胞器。鞭毛和纖毛不僅能夠作為細(xì)胞的運動推進器，也可以作為細(xì)胞感受器，接受外界環(huán)境或周圍細(xì)胞的生化信號并傳遞到細(xì)胞內(nèi)。已有研究表明人類幾乎所有的細(xì)胞都具有纖毛，然而人類細(xì)胞纖毛較短且不容易處理，故不易作為研究對象。在模式生物衣藻中鞭毛內(nèi)運輸最早被發(fā)現(xiàn)

3、，隨后這種機制也被證明存在于高等動物纖毛中。一些信號通路中重要的信號分子受體也存在于纖毛上，如PDGFαα受體，此外Wnt、Hedgehog和mTOR等信號通路也與纖毛有關(guān)。與正常細(xì)胞相比在腫瘤細(xì)胞中纖毛更容易丟失，目前在腎癌、食管癌、乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。然而纖毛在腫瘤中的缺失機制尚未完全清晰。鞭毛/纖毛的解聚需要大量纖毛相關(guān)蛋白的降解，雖然蛋白酶體已被證實參與纖毛的解聚，然而泛素連接酶相關(guān)蛋白是否參與纖毛的解聚，并

4、且影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展尚有待探索。杜氏鹽藻和衣藻同為真核單細(xì)胞綠藻，然而由于杜氏鹽藻鞭毛比衣藻鞭毛少了一層細(xì)胞壁，更適合作為研究鞭毛的模式細(xì)胞器，因而本實驗以杜氏鹽藻鞭毛作為研究對象，來檢測E3泛素連接酶亞基RBX1（Ring box protein-1）與鞭毛間的關(guān)系
　　RBX1是SCF-E3泛素連接酶中的指環(huán)亞基，而SCF-E3泛素連接酶是最大的 E3連接酶家族，能夠調(diào)節(jié)多種生理生化過程。SCF-E3泛素連接酶能夠促進多種細(xì)胞

5、內(nèi)蛋白的降解，包括一些轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子等。RBX1蛋白在N端結(jié)合cullins蛋白，在C端通過指環(huán)結(jié)構(gòu)域和連接泛素的泛素結(jié)合酶E2結(jié)合，最終催化將泛素轉(zhuǎn)移到目的蛋白進而降解。研究發(fā)現(xiàn)在多種生物中，RBX1由于調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化對于許多生物的胚胎發(fā)育十分重要。此外，RBX1在多種腫瘤中發(fā)生過表達并且調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，如胃癌、肝癌以及膀胱癌等。為了了解E3泛素連接酶在纖毛中的功能，并尋找食管鱗癌的治療靶點

6、，本研究以杜氏鹽藻鞭毛作為模式細(xì)胞器，研究SCF-E3泛素連接酶亞基RBX1與鞭毛解聚間的關(guān)系，并進而研究RBX1對食管鱗癌細(xì)胞纖毛的影響以及對細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　第一章杜氏鹽藻RBX1多克隆抗體的制備
　　目的：
　　為了探究杜氏鹽藻鞭毛解聚過程中SCF-E3泛素連接酶的變化，以杜氏鹽藻鞭毛為模式細(xì)胞器初步研究 RBX1是否參與杜氏鹽藻鞭毛的解聚，我們需要首先克隆杜氏鹽藻RBX1（DsRBX1）基因并制備抗體

7、。
　　方法:
　　依據(jù)實驗室前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，設(shè)計引物克隆杜氏鹽藻RBX1基因cDNA片段，并應(yīng)用3’-RACE的方法克隆杜氏鹽藻RBX1基因3' cDNA末端，通過拼接獲得DsRBX1基因cDNA序列全長，進一步設(shè)計引物克隆基因全長，測序驗證并進行生物信息學(xué)分析。進而將 DsRBX1基因 cDNA編碼區(qū)序列克隆到pET28a(+)載體上，得到重組表達載體pET28a-DsRBX1，轉(zhuǎn)化進入表達菌株BL21（DE3）中，

8、通過表達和純化得到DsRBX1蛋白。將DsRBX1蛋白與弗氏佐劑混合乳化，進而對健康日本大耳兔進行皮下多點注射接種，第五次免疫后一周頸靜脈取血收集血清。利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中抗體的滴度。
　　結(jié)果：
　　依據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，克隆得到杜氏鹽藻RBX1基因cDNA片段504bp，并應(yīng)用3’-RACE的方法克隆杜氏鹽藻RBX1基因3' cDNA末端455 bp，通過拼接獲得DsRBX1基因cDNA序列全長860 bp，經(jīng)過序

9、列分析，包含411 bp的開放閱讀框。該序列能夠編碼136個氨基酸殘基，分子量約為14.8 kD。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，揭示該序列與已知的其它物種 RBX1具有高度同源性。將 DsRBX1基因 cDNA編碼區(qū)序列克隆到 pET28a(+)載體，得到重組表達載體pET28a-DsRBX1，轉(zhuǎn)化進入表達菌株 BL21（DE3）中，通過表達和純化得到DsRBX1蛋白。純化的蛋白用于制備多克隆抗體，利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測制備的血清中抗體的滴度，顯

10、示兔抗DsRBX1多抗的效價達到1:512000。
　　結(jié)論：
　　克隆得到在進化中高度保守的 DsRBX1基因全長序列，重組表達得到DsRBX1蛋白，進而制備了DsRBX1的多克隆抗體。
　　第二章 RBX1對杜氏鹽藻鞭毛調(diào)控作用的初步研究
　　目的：
　　為了探究杜氏鹽藻鞭毛解聚過程中SCF-E3泛素連接酶的變化，以杜氏鹽藻鞭毛為模式細(xì)胞器初步研究SCF-E3泛素連接酶亞基RBX1是否參與杜氏鹽藻鞭毛的

11、解聚。
　　方法：
　　用收集得到的兔抗DsRBX1多克隆抗體，測定DsRBX1蛋白在杜氏鹽藻鞭毛經(jīng)1 mM IBMX誘導(dǎo)解聚后的變化。分別提取2小時內(nèi)鞭毛解聚后的杜氏鹽藻RNA和蛋白，從而檢測杜氏鹽藻鞭毛解聚時DsRBX1在RNA水平和蛋白水平上的變化。
　　結(jié)果：
　　IBMX誘導(dǎo)杜氏鹽藻鞭毛解聚后，杜氏鹽藻鞭毛在2小時后又基本恢復(fù)正常長度。RT-PCR和Western blotting結(jié)果均顯示DsRBX1

12、蛋白顯著升高后又逐漸恢復(fù)正常水平。
　　結(jié)論：
　　在杜氏鹽藻鞭毛解聚過程中DsRBX1表達水平顯著升高，說明DsRBX1參與杜氏鹽藻鞭毛的解聚。
　　第三章 RBX1在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用
　　目的：
　　為了研究SCF-E3泛素連接酶亞基RBX1在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們檢測了 RBX1在食管鱗癌細(xì)胞中的表達情況，以及干擾后對食管鱗癌細(xì)胞增殖凋亡及細(xì)胞纖毛的影響。
　　方法：
　　

13、通過Western blotting檢測RBX1蛋白在正常食管上皮細(xì)胞Het-1A和三株食管鱗癌細(xì)胞系EC9706、EC1、Eca109中的表達水平。構(gòu)建RBX1的shRNA慢病毒干擾三株食管鱗癌細(xì)胞中RBX1的表達，檢測對三株細(xì)胞增殖、周期、凋亡以及侵襲能力的影響，并檢測了RBX1干擾后食管鱗癌細(xì)胞中纖毛數(shù)量的變化。同時在裸鼠背部接種干擾RBX1后的食管鱗癌細(xì)胞EC9706，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，檢測干擾RBX1對食管鱗癌細(xì)胞致瘤能力的

14、影響，致瘤三天左右開始測量腫瘤大小，最終計算腫瘤抑制率及繪制腫瘤組織的生長曲線，病理組織分析移植瘤的細(xì)胞形態(tài)并用TUNEL法檢測腫瘤組織的細(xì)胞凋亡水平。
　　結(jié)果：
　　Western blotting檢測結(jié)果顯示，RBX1蛋白在三株食管鱗癌細(xì)胞系EC9706、EC1、Eca109中的表達量均高于正常食管上皮細(xì)胞Het-1A中的表達。shRNA慢病毒干擾三株食管鱗癌細(xì)胞中 RBX1的表達，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖及侵襲能力降低，細(xì)胞

15、凋亡率增加，同時檢測到干擾后食管鱗癌細(xì)胞中纖毛數(shù)量明顯恢復(fù)。在構(gòu)建的裸鼠移植瘤模型中，干擾RBX1后的食管鱗癌細(xì)胞EC9706生長受抑制，腫瘤體積縮小到對照組的約1/2，病理組織檢測顯示成瘤細(xì)胞異質(zhì)性降低， TUNEL顯示干擾RBX1的組織中細(xì)胞凋亡增加。
　　結(jié)論：
　　RBX1蛋白在食管鱗癌細(xì)胞中表達增高，干擾RBX1的表達能顯著抑制細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞的侵襲能力，并且細(xì)胞纖毛也明顯恢復(fù)，進一步在構(gòu)建的裸鼠移

16、植瘤模型中干擾RBX1，食管鱗癌移植瘤體積明顯減小。
　　第四章 RBX1調(diào)控食管鱗癌發(fā)生的分子機制
　　目的：
　　為了研究SCF-E3泛素連接酶亞基RBX1在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們進一步檢測了影響食管鱗癌細(xì)胞增殖凋亡及細(xì)胞纖毛變化的重要蛋白分子的變化。
　　方法：
　　通過Western blotting，分別檢測RBX1干擾后影響食管鱗癌細(xì)胞遷移的蛋白E-cadherin，影響細(xì)胞凋亡的抗凋亡

17、蛋白Bcl-2及影響細(xì)胞纖毛的纖毛相關(guān)蛋白Aurora A，并檢測mTOR信號通路中關(guān)鍵分子的表達情況，進一步通過在正常食管上皮細(xì)胞Het-1A中過表達RBX1檢測對mTOR信號通路的影響。
　　結(jié)果：
　　通過Western blotting檢測顯示，與shCon干擾后的食管鱗癌細(xì)胞相比， E-cadherin在shRBX1干擾后的細(xì)胞中表達明顯升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯下調(diào)，而mTOR信號通路中關(guān)鍵分子Akt,