E3泛素化連接酶CHIP在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:本研究試圖闡明E3泛素化連接酶CHIP在胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞中的作用以及探討其潛在的生物學(xué)機(jī)制。
　　方法:應(yīng)用qRT-PCR、Western blot以及IHC等方法檢測(cè)胃癌組織中CHIP的表達(dá)情況。采用慢病毒感染宿主細(xì)胞的方法轉(zhuǎn)染MSCV-GFP-hCHIP質(zhì)粒并建立穩(wěn)定高表達(dá)CHIP的胃癌細(xì)胞株AGS-hCHIP。通過xCELLigence系統(tǒng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察CHIP高表達(dá)后細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞侵襲能力的變化。應(yīng)用流

2、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CHIP高表達(dá)后細(xì)胞周期的變化。采用Ki-67染色法以及TUNEL法檢測(cè)CHIP高表達(dá)后細(xì)胞增殖以及細(xì)胞凋亡的變化。通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察CHIP高表達(dá)后細(xì)胞遷移能力的變化。采用明膠酶譜MMP活性檢測(cè)方法檢測(cè)CHIP高表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)金屬蛋白酶活性的變化。應(yīng)用qRT-PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因在mRNA水平以及蛋白水平的表達(dá)。通過Western blot技術(shù)檢測(cè)CHIP高表達(dá)后對(duì)細(xì)胞內(nèi)AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白以

3、及TRAF-NF-κB信號(hào)通路相關(guān)家族成員蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:胃癌組織中CHIP在mRNA水平以及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均較正常組織呈相對(duì)低表達(dá)，且CHIP的表達(dá)量與胃癌的分化程度及TNM分期有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。在胃癌細(xì)胞株AGS中分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MSCV-GFP-hCHIP質(zhì)粒和MSCV-GFP質(zhì)粒，成功獲得實(shí)驗(yàn)組穩(wěn)定高表達(dá)CHIP的AGS-hCHIP細(xì)胞和對(duì)照組AGS-control細(xì)胞。AGS-hCHIP細(xì)胞的生

4、長(zhǎng)速度明顯慢于AGS-control細(xì)胞，并且遷移、侵襲能力均較AGS-control細(xì)胞顯著減弱。AGS-hCHIP細(xì)胞與AGS-control細(xì)胞在細(xì)胞周期上無明顯差異。AGS-hCHIP細(xì)胞的增殖能力較AGS-control細(xì)胞顯著減弱。AGS-hCHIP細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比較AGS-control細(xì)胞明顯增多。AGS-hCHIP細(xì)胞中ITGB1基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均較AGS-control細(xì)胞顯著下調(diào)。AGS-hCH

5、IP細(xì)胞中的MMP-2、MMP-9蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均較AGS-control細(xì)胞顯著下調(diào)，同時(shí)明膠酶譜MMP活性檢測(cè)方法檢測(cè)顯示AGS-hCHIP細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)顯著低于AGS-control細(xì)胞。AGS-hCHIP細(xì)胞中Bcl-2基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均較AGS-control細(xì)胞明顯下調(diào)，其余相關(guān)基因Bcl-xl、cIAP1、Bax、A20、Bim、Mcl-1在mRNA水平的表達(dá)無明顯變化。AGS-hCH

6、IP細(xì)胞中pAKT(Ser473)及pAKT(Thr308)的蛋白表達(dá)水平較AGS-control細(xì)胞呈明顯下調(diào)。AGS-hCHIP細(xì)胞中RelA、p50、RelB及TRAF-2的蛋白表達(dá)水平較AGS-control細(xì)胞顯著下調(diào)。
　　結(jié)論: CHIP在胃癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌基因的角色，可以作為判斷胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后的參考指標(biāo)。在胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞中高表達(dá)CHIP能顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移以及侵襲等惡性生物學(xué)行為。高

7、表達(dá)CHIP顯著抑制了胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞的生長(zhǎng)，與細(xì)胞增殖能力減弱及細(xì)胞凋亡增多相關(guān)，Bcl-2基因的下調(diào)及AKT信號(hào)通路活性的抑制可能是其潛在的原因。高表達(dá)CHIP顯著抑制了AGS胃癌細(xì)胞株中TRAF-2-NF-κB信號(hào)通路的活性，導(dǎo)致了NF-κB信號(hào)通路下游一系列靶基因如ITGB1、MMP-2及MMP-9表達(dá)水平的下調(diào)，這可能是CHIP抑制胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的重要機(jī)制之一。CHIP有望作為胃癌分子靶向治療的新靶點(diǎn)，應(yīng)用CHIP