E3泛素連接酶CHIP和Nrdp1在免疫應(yīng)答反應(yīng)中的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、泛素化修飾在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，廣泛參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育以及免疫應(yīng)答反應(yīng)的各個(gè)階段。關(guān)于E3泛素連接酶參與免疫應(yīng)答反應(yīng)調(diào)控，包括E3泛素連接酶新成員的發(fā)現(xiàn)或新調(diào)控機(jī)制的提出一直是免疫學(xué)研究領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(BMDC)和原代腹腔巨噬細(xì)胞全基因表達(dá)譜芯片的E3泛素連接酶表達(dá)譜分析。根據(jù)芯片數(shù)據(jù)和前期研究成果，我們選擇了E3泛素連接酶CHIP和Nrdp1開展了進(jìn)一步的研究。CHIP(

2、CarboxylterminusofHsc70-interactingprotein，CHIP)是一個(gè)與分子伴侶相關(guān)的含有U-box功能域的E3泛素連接酶，目前關(guān)于CHIP在天然免疫中的調(diào)控作用以及其作用機(jī)制研究尚不清楚。在此，我們探討了CHIP在TLRs信號(hào)通路中的調(diào)控作用以及分子機(jī)制。在Raw264.7細(xì)胞、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、BMDC以及pDC細(xì)胞中，CHIP干擾后可以顯著抑制TLR214/7/9信號(hào)通路觸發(fā)的促炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干

3、擾素(IL-6、TNF-α和IFN-β)的產(chǎn)生。在BMDC中，CHIP干擾后顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的IL-12p70的產(chǎn)生以及BMDC的表型成熟。在APC中，CHIP干擾后能明顯抑制LPS/CpG誘導(dǎo)的NF-κB、IRF3和IRF7的活化以及核轉(zhuǎn)移，同時(shí)IL-6、IFN-β和CCL5的報(bào)告基因活化也顯著受到抑制；相應(yīng)的，CHIP過表達(dá)則產(chǎn)生相反的結(jié)果。通過GSTPull-down和免疫共沉淀試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)CHIP可以結(jié)合HSP70、TLR

4、4/9以及Src和PKCζ，并通過共聚焦顯微鏡檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)該相互作用。在穩(wěn)定表達(dá)CHIP-HA的Raw264.7細(xì)胞，CHIP能促進(jìn)LPS/CpG誘導(dǎo)的Src和PKCζ的磷酸化；而CHIP被干擾后，Src和PKCζ的磷酸化受到明顯抑制。體外激酶活性實(shí)驗(yàn)提示，在Raw264.7細(xì)胞中，CHIP干擾后能顯著抑制IRAK1和TBK1的激酶活性，而CHIP-HA過表達(dá)能明顯增強(qiáng)IRAK1和TBK1的激酶活性。體內(nèi)和體外泛素化實(shí)驗(yàn)提示CHIP能

5、夠介導(dǎo)Src和PKCζ發(fā)生K63-linked的多聚泛素化并促使Src和PKCζ活化。通過以上的研究，我們對(duì)CHIP參與天然免疫調(diào)控得出以下結(jié)論：經(jīng)TLRs配體如LPS/CpG刺激后，CHIP可以募集Src和PKCζ并介導(dǎo)其發(fā)生K63-linked的多聚泛素化而活化，進(jìn)而通過NF-kB信號(hào)通路或TBK1和IRAK1信號(hào)通路活化IRF3和IRF7并最終促使促進(jìn)炎性因子和干擾素的產(chǎn)生。本部分研究揭示了CHIP在病原體模式識(shí)別信號(hào)通路中發(fā)揮重

6、要調(diào)節(jié)作用的一個(gè)新功能，較深入揭示了CHIP與Src/PKCζ復(fù)合體對(duì)TLR4/9的調(diào)節(jié)作用；該研究豐富了TLR信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)制，創(chuàng)新性地提出Src/PKCζ調(diào)節(jié)TBK1和IRAK1并進(jìn)而活化IRF3/7的通路，為Ⅰ型干擾素的調(diào)節(jié)機(jī)制研究提出了新的角度。
　　 我們前期工作研究了E3泛素連接酶Nrdp1參與天然免疫的作用及相關(guān)機(jī)制，但是對(duì)于Nrdp1在適應(yīng)性免疫中的作用尚未有報(bào)導(dǎo)。我們發(fā)現(xiàn)Nrdp1優(yōu)勢(shì)表達(dá)于CD8+T細(xì)胞，顯

7、示Nrdp1可能與CD8+T細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)密切相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Nrdp1E3泛素連接酶功能缺失(DN-Nrdp1)后能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ、穿孔素和顆粒酶，并且抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的發(fā)展和促進(jìn)EAE的緩解。為進(jìn)一步驗(yàn)證Nrdp1與EAE的關(guān)系，我們將DN-Nrdp1CD8+T細(xì)胞回輸，發(fā)現(xiàn)其可以抑制EAE的病程。這些結(jié)果提示Nrdp1可能參與調(diào)控CD8+T細(xì)胞的功能和T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，但其