豬早期胚胎發(fā)育及滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化機(jī)理的相關(guān)研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物第一次胚層分化發(fā)生在囊胚腔形成過程中。囊胚形成前，胚胎由一個(gè)全能的受精卵分裂形成多個(gè)發(fā)育潛力幾乎相同的卵裂球。隨后胚胎的形態(tài)會(huì)發(fā)生顯著改變，形成一個(gè)空腔，同時(shí)卵裂球也會(huì)分化形成外層的滋養(yǎng)層細(xì)胞（Trophectoderm，TE）和內(nèi)部的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(Inner cell mass，ICM)。這兩種細(xì)胞進(jìn)一步的發(fā)育走向不同，滋養(yǎng)層會(huì)成為胎盤部分，而內(nèi)細(xì)胞團(tuán)成為胎體和少部分胎盤組織。盡管小鼠中TE與ICM分化的進(jìn)程和分子機(jī)理已經(jīng)得到

2、清晰的闡述，但在其他哺乳動(dòng)物中卻知之甚少。最近一些研究結(jié)果表明，豬中TE與ICM分化的相關(guān)事件與小鼠中存在差異，這說明小鼠TE與ICM的分化模式并不能代表所有哺乳動(dòng)物。
　　在小鼠中TE與ICM的分化依賴于轉(zhuǎn)錄因子CDX2與OCT4的相互抑制作用。CDX2最初在小鼠桑椹胚部分卵裂求中開始表達(dá)，并逐漸在部分外部細(xì)胞中富集，最終在囊胚TE中特異性表達(dá)。與此相反，OCT4在所有小鼠早期所有卵裂球中均表達(dá)，直至囊胚期，OCT4逐漸向ICM

3、中富集，并最終在ICM中特異性表達(dá)。在TE細(xì)胞中，OCT4直接受到CDX2轉(zhuǎn)錄水平的抑制，而ICM中由于沒有CDX2的表達(dá)，OCT4可以正常表達(dá)。有報(bào)道表明，小鼠中CDX2受到Y(jié)AP-TEAD轉(zhuǎn)錄共激活因子的調(diào)控，而YAP的活性受到其上游信號(hào)通路Hippo和ROCK的調(diào)控。
　　而豬中的相關(guān)研究結(jié)果表明，雖然CDX2在TE細(xì)胞中特異性表達(dá)，但是OCT4即使在晚期孵化囊胚中還仍然在TE和ICM中廣泛表達(dá)。這兩個(gè)因子如此長(zhǎng)時(shí)間的共表達(dá)

4、于TE細(xì)胞說明CDX2不能夠高效的抑制OCT4的表達(dá)，OCT4也不是一個(gè)對(duì)于滋養(yǎng)層分化反映敏感的轉(zhuǎn)錄因子。這說明在豬中TE與ICM分化的分子基礎(chǔ)可能與小鼠不同。
　　更為重要的是，目前豬TE與ICM分化的進(jìn)程沒有得到清晰的闡述，滋養(yǎng)層與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)特異性因子也不清楚。這些基礎(chǔ)信息的未知極大阻礙了進(jìn)一步研究豬滋養(yǎng)層與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化的分子機(jī)理。為此，我們首先對(duì)豬滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)標(biāo)記因子進(jìn)行了篩選，通過免疫熒光追蹤C(jī)DX2在豬體內(nèi)和體外胚胎中

5、的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)雖然CDX2在豬滋養(yǎng)層細(xì)胞中特異性表達(dá)，但是CDX2在豬囊胚期才開始表達(dá)，這在發(fā)育時(shí)程上晚于小鼠（桑椹胚期開始表達(dá)），說明滋養(yǎng)層分化的調(diào)控機(jī)理或者關(guān)鍵事件在豬與小鼠中可能不同。之后我們通過免疫熒光的方法篩選了在豬內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中特異性表達(dá)的因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SOX2特異性的在豬胚胎部分、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和上胚層中表達(dá)，并且與CDX2呈現(xiàn)互斥的表達(dá)模式，這些結(jié)果說明SOX2是豬早期胚胎多潛能特異標(biāo)記因子。根據(jù)這些因子的表達(dá)，與小鼠已有資料對(duì)

6、比，我們總結(jié)了豬早期胚胎發(fā)育過程中的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)時(shí)程，首次系統(tǒng)的揭示了豬特有的滋養(yǎng)層與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化的分子基礎(chǔ)和特有的胚層分化進(jìn)程。
　　已有報(bào)道顯示FBS可以促進(jìn)豬體外囊胚孵化，提高體外囊胚細(xì)胞數(shù)，但FBS是成分不明確的混合物質(zhì)，且以往由于沒有明確的分子標(biāo)記可以反應(yīng)豬ICM和TE細(xì)胞，無法準(zhǔn)確FBS對(duì)豬胚胎發(fā)育的影響。這不但大大限制了FBS在豬體外培養(yǎng)過程的應(yīng)用，也限制了豬體外培養(yǎng)優(yōu)化相關(guān)研究工作的進(jìn)展。而本文在揭示了豬滋養(yǎng)層

7、與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化分子基礎(chǔ)之后利用CDX2和SOX2分別標(biāo)記豬滋養(yǎng)層與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了FBS對(duì)于豬早期胚胎發(fā)育胚層分化的影響，結(jié)果顯示，F(xiàn)BS可以提高豬體外胚胎囊胚孵化率和細(xì)胞數(shù)，同時(shí)CDX2和SOX2免疫熒光結(jié)果顯示，F(xiàn)BS可以提高豬內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞比例以及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步分化的能力。由此我們明確了FBS在改善豬體外胚胎培養(yǎng)體系中的價(jià)值，為我們下一步體外獲得發(fā)育進(jìn)程更加接近體內(nèi)的胚胎提供了重要線索。
　　之前我們

8、的結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDX2在豬胚胎中起始表達(dá)晚于小鼠，為此我們系統(tǒng)地比較了豬與小鼠相同細(xì)胞數(shù)的胚胎中CDX2的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDX2在豬囊胚期開始表達(dá)，而小鼠桑葚胚期便已開始表達(dá)。因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了CDX2上游調(diào)控因子YAP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)YAP的核定位與CDX2表達(dá)同時(shí)發(fā)生，同時(shí)利用Y27632阻斷ROCK通路進(jìn)而抑制YAP入核也會(huì)抑制CDX2的表達(dá)，這說明豬中同小鼠一樣CDX2的表達(dá)受ROCK-YAP通路調(diào)控。由于有報(bào)道顯示ROCK通路通

9、過與細(xì)胞極性互作來調(diào)控YAP入核和CDX2表達(dá)，我們也檢測(cè)了豬胚胎極化的進(jìn)程。免疫熒光檢測(cè)極性蛋白P-EZRIN表達(dá)的結(jié)果顯示，與小鼠相比，豬胚胎細(xì)胞極化時(shí)間發(fā)生在桑椹胚期，晚于小鼠（8-細(xì)胞期開始），此外只有部分豬桑椹胚和早期囊胚外層卵裂球發(fā)生極化，而小鼠中幾乎所有外層卵裂球此發(fā)育階段均已發(fā)生極化。這些結(jié)果說明，豬中CDX2起始表達(dá)晚于小鼠可能是由于極化這一胚層分化重要前提事件在豬中的進(jìn)程與小鼠中不同，這為我們進(jìn)一步研究豬特有的胚層分

10、化機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。
　　由于之前我們的結(jié)果表明OCT4和CDX2長(zhǎng)時(shí)間共同表達(dá)于豬滋養(yǎng)層中，這可能說明OCT4和CDX2在豬早期胚胎中的互作方式及豬中滋養(yǎng)層與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化的分子機(jī)制與小鼠中存在不同。為此，我們以豬卵裂期胚胎為研究對(duì)象進(jìn)一步研究了CDX2和OCT4在豬早期胚胎中的作用方式。結(jié)果顯示早期胚胎中CDX2的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致豬胚胎發(fā)育阻滯，而這種阻滯可以通過過表達(dá)OCT4來挽救，這說明CDX2的過表達(dá)是通過抑制OCT4的表達(dá)

11、或者功能導(dǎo)致的胚胎發(fā)育阻滯。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)早期胚胎中CDX2的過表達(dá)不會(huì)影響OCT4轉(zhuǎn)錄及翻譯水平，而會(huì)在翻譯后水平通過競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制抑制OCT4與DNA的可觸性，從而促進(jìn)OCT4出核降解。而這種作用模式與小鼠中已有的CDX2與OCT4直接相互抑制彼此表達(dá)的研究結(jié)果有所不同，為我們進(jìn)一步研究豬胚層分化過程中CDX2與OCT4的互作模式提供了研究基礎(chǔ)。
　　這些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了豬特有的胚層分化進(jìn)程及分子基礎(chǔ)，補(bǔ)充了我們對(duì)哺乳動(dòng)物胚層分化模式