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文檔簡介
1、金黃色葡萄球菌(金葡菌)是臨床常見的條件致病菌,致病力強(qiáng),可引起輕微的皮膚軟組織感染,也可引起威脅生命的中毒性休克綜合征、敗血癥、骨髓炎等多種疾病。金葡菌極易產(chǎn)生耐藥性,其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)最為常見。萬古霉素是目前臨床治療MRSA感染的首選藥物,也被認(rèn)為是抵御革蘭陽性菌感染的最后一道防線。但隨著萬古霉素用量的增加,近年來出現(xiàn)了萬古霉素耐藥的金葡菌。盡管目前對萬古霉素完全耐藥(高水平耐藥)的金葡菌仍非常罕見,但越來越多
2、的文獻(xiàn)報道檢出低水平萬古霉素耐藥金葡菌,包括萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌(VISA)和萬古霉素異質(zhì)性中介耐藥金黃色葡萄球菌(hVISA)。與萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌(VRSA)不同,hVISA/VISA沒有明確的耐藥基因介導(dǎo),而是金葡菌在萬古霉素選擇壓力下產(chǎn)生的適應(yīng)性耐藥,常伴有細(xì)胞壁增厚、生長緩慢、毒力減低等適應(yīng)性改變。這些變化可導(dǎo)致萬古霉素滲透障礙,細(xì)菌難以被清除,感染反復(fù)發(fā)作,增加了臨床治療的難度。生物膜是細(xì)菌抵御抗菌藥物和宿
3、主免疫攻擊的胞外屏障,與金葡菌耐藥和致病密切相關(guān)。hVISA/VISA生物膜形成是否也發(fā)生了改變尚存爭議,本課題重點對hVISA/VISA生物膜形成能力和機(jī)制開展研究。
目的:本研究旨在明確hVISA/VISA生物膜形成能力是否發(fā)生改變。研究生物膜形成與耐藥之間的相關(guān)性,探討生物膜形成機(jī)制和分子調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步認(rèn)識hVISA/VISA的生存方式和致病特征。
方法:(1)利用含3μg/ml萬古霉素的腦心
4、浸液(BHI)瓊脂平板(BHI-V3)篩選臨床分離的金葡菌中萬古霉素低水平耐藥菌株,對兩組細(xì)菌的遺傳背景、生物膜形成能力進(jìn)行比較。(2)隨機(jī)選擇一株可以在BHI-V3平板上生長的萬古霉素低水平耐藥菌株0534用萬古霉素進(jìn)行體外誘導(dǎo),使其MIC值逐步升高,獲得系列萬古霉素梯度耐藥的菌株。用微孔成膜法及激光共聚焦顯微鏡檢測菌株的生物膜形成能力。(3)應(yīng)用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測0534及其系列誘導(dǎo)菌株的生物膜形成調(diào)控相關(guān)基因
5、(icaA、icaR、fnbA、SarA、agr、atlA和lrgAB)及耐藥調(diào)控二元信號系統(tǒng)VraSR轉(zhuǎn)錄水平。(4)使用免疫斑點印記法測定細(xì)菌的胞外多糖粘附素(PIA)產(chǎn)生能力。(5)利用凝膠遷移阻滯實驗(EMSA)檢測與金黃色葡萄球菌生物膜形成基因(icaA、icaR和fnbA)及調(diào)控基因(Agr、atlA和SarA)啟動子區(qū)域的結(jié)合情況。DNase I足跡印記實驗鑒定VraR蛋白與靶基因啟動子區(qū)的結(jié)合位點。
結(jié)果:(1
6、)本研究共收集臨床分離的金葡菌176株。其中16株金葡菌可在BHI-V3篩選平板上生長,命名為 GV3。經(jīng)鑒定這16株菌株均為MRSA。故我們隨機(jī)挑選16株不在BHI-V3篩選平板上生長的MRSA菌株作為對照組,命名為NGV3組。兩組菌株遺傳背景基本一致,多為 agr II、SCCmec III、t030型。微孔成膜法檢測顯示,所有GV3菌株均可形成明顯的紫色斑狀固著物,而NGV3組僅有部分菌株可形成一層薄薄的紫色固著物。結(jié)晶紫染色半定
7、量分析顯示,GV3組菌株平均吸光度值明顯高于NGV3組(0.336±0.088 Vs0.109±0.036)。
?。?)0534菌株經(jīng)過萬古霉素體外傳代誘導(dǎo)后,可獲得系列不同萬古霉素耐藥水平的菌株,最高萬古霉素MIC值可達(dá)32μg/ml。與原代菌株相比,系列萬古霉素梯度耐藥菌株均可形成紫色斑狀固著物,并且隨著萬古霉素MIC值的升高,顏色逐漸加深。結(jié)晶紫染色半定量分析顯示,誘導(dǎo)菌株0534-V8(1.74±0.10)、0534-V
8、16(2.23±0.07)和0534-V32(2.85±0.05)平均吸光度值明顯高于原代菌株0534(0.41±0.03)。激光共聚焦顯微鏡觀察菌株生物膜三維立體結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)較之原代菌株0534,系列萬古霉素梯度耐藥菌株均形成了緊湊的、厚的生物膜。其中,0534-V32菌株生物膜平均厚度為12±0.7μm,遠(yuǎn)大于0534菌株生物膜平均厚度(2±0.4μm)。
?。?)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,與NGV3組菌株相比,GV3菌株
9、icaA和 fnbA轉(zhuǎn)錄水平分別增高了1.67倍和3.44倍。而icaR和agr轉(zhuǎn)錄水平下降了1.88倍和2.18倍。與原代菌株相比,系列萬古霉素梯度耐藥誘導(dǎo)株 icaA、fnbA、atlA和 sarA轉(zhuǎn)錄水平均明顯上升,而icaR、agr轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。且基因表達(dá)水平的變化與菌株萬古霉素MIC升高的程度密切相關(guān)。
?。?)相較之于原代菌株,系列萬古霉素耐藥誘導(dǎo)株的PIA表達(dá)均明顯增高。其中0534-V32菌株P(guān)IA表達(dá)量是0
10、534菌株的5.31倍。且PIA表達(dá)水平增高與菌株萬古霉素MIC升高的程度密切相關(guān)。
?。?)與NGV3組菌株相比,GV3菌株耐藥相關(guān)雙組份調(diào)控系統(tǒng)VraSR轉(zhuǎn)錄水平增高了2.20倍。與原代菌株相比,系列萬古霉素梯度耐藥誘導(dǎo)株VraSR轉(zhuǎn)錄水平均明顯上升,與促生物膜形成基因(icaA、fnbA、atlA和 sarA)表達(dá)量呈正相關(guān),與抑制生物膜形成的icaR、agr表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。使用重組表達(dá)并純化的rVraR蛋白,進(jìn)行凝膠遷移
11、阻滯實驗,結(jié)果顯示VraR不能與fnbA、icaADBC、sar、atlA基因的啟動子區(qū)域直接結(jié)合。但可以與Agr啟動子區(qū)域直接結(jié)合。DNase I足跡印記實驗進(jìn)一步驗證表明VraR與agr啟動子區(qū)的結(jié)合位點位于P2和P3啟動子之間。
結(jié)論:(1)hVISA/VISA生物膜形成增加,且隨著萬古霉素MIC值升高,生物膜形成能力逐漸增強(qiáng)。(2)hVISA/VISA可通過FnbA高表達(dá)和PIA依賴途徑促進(jìn)生物膜形成。(3)萬古霉素耐
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