萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性及耐藥機(jī)制研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種重要的人畜感染病原菌,常定植于人體皮膚和鼻腔,可引起皮膚、軟組織等的局部化膿性感染,也可引起菌血癥、腦膜炎、骨髓炎等嚴(yán)重全身性感染疾病,在醫(yī)院環(huán)境中可廣泛分布并傳播,自20世紀(jì)40年代青霉素應(yīng)用于臨床以來,該菌的感染情況曾受到較大控制,隨著青霉素的廣泛應(yīng)用,出現(xiàn)了能產(chǎn)生青霉素酶的菌株,表現(xiàn)出對青霉素的耐藥性,于是二甲氧苯基青霉素,即甲氧西林,1959年開始應(yīng)用于臨床,但是

2、在甲氧西林應(yīng)用于臨床兩年后,在英國分離到了首例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA),至今,MRSA感染已遍及全球,是全球院內(nèi)感染的首要致病菌,MRSA表現(xiàn)出的多重耐藥性及其對環(huán)境很強(qiáng)的適應(yīng)能力,使其感染情況尤為嚴(yán)重,與乙型肝炎、艾滋病并稱為世界范圍的三大難治感染性疾病。目前以萬古霉素為代表的糖肽類抗生素是治療MRSA感染的最后用藥,然而,隨著萬古霉

3、素在臨床上應(yīng)用的增加,出現(xiàn)了萬古霉素敏感性降低金黃色葡萄球菌,近年來異質(zhì)性中介耐藥金黃色葡萄球菌(heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus,hVISA)、萬古霉素中介的金黃色葡萄球菌(vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus,VISA)和完全耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌(vancomycin-resistant

4、Staphylococcus aureus,VRSA)在國內(nèi)外時(shí)有報(bào)道,這使臨床MRSA感染的治療面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn),但是金黃色葡萄球菌對萬古霉素敏感性逐漸降低的發(fā)生機(jī)制并未被完全闡明,涉及到細(xì)菌多個(gè)方面的改變,主要有以下幾種觀點(diǎn):
　　(1)細(xì)胞壁增厚;
　　(2)青霉素結(jié)合蛋白的改變;
　　(3)自溶能力下降;
　　(4)基因突變與轉(zhuǎn)錄水平變化;
　　(5)耐藥基因轉(zhuǎn)移。
　　本研究以從臨床病人分離的一

5、株萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌XN108為研究對象,對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究并初步探討其耐藥發(fā)生機(jī)制。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.細(xì)菌分離鑒定
　　通過細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀的鑒定、MRSA特異性基因的檢測確定XN108為MRSA菌株,并對其進(jìn)行藥敏檢測,鑒定其對各種抗生素的耐藥情況。利用肉湯稀釋法和E-test試紙條法測定XN108對萬古霉素耐藥MIC值,為12μg/ml;菌群分析實(shí)驗(yàn)分析XN108對萬古霉素的耐藥性。

6、>　　2. XN108分子分型
　　通過多位點(diǎn)序列分析(multilocus sequence typing, MLST)、脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)、金黃色葡萄球菌表面蛋白 A多變區(qū)分型(X region encoding staphylococcal protein A,spa typing)、金黃色葡萄球菌染色體盒mec元件分型(staphylococcal

7、cassette chromosome mec typing,SCCmec typing)等基因分型的技術(shù)手段證實(shí)XN108是一株ST239-MRSA-SCCmec type III菌株, spa型別為t037。
　　3. XN108生物學(xué)特性研究
　　測定XN108菌株生長曲線,結(jié)果顯示XN108的生長速率較萬古霉素敏感菌慢,約在培養(yǎng)3.5h時(shí)開始生長;檢測XN108菌株溶血活性,可見XN108溶血活性下降;測定XN108

8、菌株自溶曲線,可見相對于MSSA ATCC25923,XN108的自溶能力有所下降,以上生物學(xué)特性均與VISA Mu50情況相似。
　　4. XN108對萬古霉素耐藥機(jī)制研究
　　以XN108基因組DNA為模板,用特異性引物檢測萬古霉素耐藥基因,未能檢測到;透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞壁,結(jié)果顯示XN108細(xì)胞壁相對于VSSA ATCC25923,細(xì)胞壁有2倍以上增厚;qRT-PCR檢測XN108菌株細(xì)胞壁合成相關(guān)基因,結(jié)果顯示X

9、N108在含8mg/ml萬古霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng),相對于無抗生素培養(yǎng)時(shí),pbpB基因表達(dá)上調(diào)約6倍,另外glmU、murG基因表達(dá)均有顯著升高;剛果紅敏感試驗(yàn)顯示XN108對剛果紅敏感;利用攜帶轉(zhuǎn)座子TN917的質(zhì)粒pID408構(gòu)建XN108轉(zhuǎn)座子突變文庫,并用一定濃度的萬古霉素對突變文庫進(jìn)行篩選,篩選到能在16μg/ml VAN,24μg/ml VAN和36μg/ml VAN條件下穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的突變株,將其命名為XN16+,XN24+和

10、XN36+。
　　5. XN108及其突變株全基因組生物信息學(xué)分析
　　對XN108、XN16+、XN24+和XN36+進(jìn)行全基因組測序后分析,XN108的完整基因組包含一個(gè)圓形3,052,037 bp的染色體,G+C含量為32.76％,有一個(gè)31,500 bp的環(huán)狀質(zhì)粒,與已知的金黃色葡萄球菌的基因組序列進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)所測序的四株菌的基因組中的GraR調(diào)控元件區(qū)有缺失突變。這種突變可能是XN108發(fā)生萬古霉素中介耐藥的重要