基于譜效關(guān)系的黑骨藤藥效物質(zhì)辨識(shí)研究.pdf

1、黑骨藤為蘿摩科（Asclepiasaceae）杠柳屬（Periploca）植物黑龍骨（Periploca forrestiiSchltr.）的根及根莖，大部分生長(zhǎng)于陰暗潮濕之處，或者有水源的峭壁之上；主要分布于我國(guó)西部及南部地區(qū)如貴州、廣西、四川、青海、西藏等地。黑骨藤全株入藥，具有通經(jīng)、活血、解毒、祛風(fēng)的功效，民間廣泛應(yīng)用于治療閉合性軟組織損傷、風(fēng)濕與類風(fēng)濕等疾病。
　　中藥有效物質(zhì)的辨識(shí)一直是中藥現(xiàn)代化研究中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。為了

2、尋求一種黑骨藤藥效物質(zhì)辨識(shí)的方法，本論文在國(guó)家自然基金的資助下，于課題組前期對(duì)黑骨藤80％乙醇提取部位指紋圖譜及譜效關(guān)系探索性研究的基礎(chǔ)上，開(kāi)展了相關(guān)藥效物質(zhì)辨識(shí)研究：通過(guò)對(duì)分離材料的篩選，優(yōu)選出大孔樹(shù)脂為分離材料，對(duì)黑骨藤80%乙醇提取部位組分群進(jìn)行分離制備；并對(duì)分離得到的各個(gè)組分群進(jìn)行體外抗過(guò)敏、體外抗氧化、乙酰膽堿酯酶抑制活性、細(xì)胞毒性等藥效學(xué)優(yōu)選研究，從而選出活性較強(qiáng)的組分；然后采用紫外吸收光譜和高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行藥效物質(zhì)辨

3、識(shí)研究，結(jié)果顯示，組分中主要成分為黃酮類化合物；基于藥效物質(zhì)辨識(shí)的結(jié)果，以黑骨藤總黃酮提取率為指標(biāo)進(jìn)行超聲預(yù)處理微波提取工藝研究，優(yōu)化提取工藝條件，并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行體外抗過(guò)敏活性驗(yàn)證。通過(guò)上述研究，為黑骨藤及其制劑的深度開(kāi)發(fā)利用和質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：
　　1．黑骨藤有效成分群的分離與富集
　　此部分研究對(duì)黑骨藤80%乙醇提取液進(jìn)行了分離制備：通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到大孔樹(shù)脂為最佳分離材料，并對(duì)溶劑洗脫系統(tǒng)進(jìn)

4、行了優(yōu)化：采用5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%至95%乙醇分段洗脫，通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)洗脫液出峰情況，對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，合并收集相同組分，歷時(shí)6個(gè)月，分離富集了6段黑骨藤組分群A（18g）、B（8g）、C（5g）、D（10g）、E（10g）、F（10g）。根據(jù)組分群的高效液相色譜圖，與黑骨藤80%乙醇提取部位指紋圖譜進(jìn)行歸屬分析：指紋圖譜上標(biāo)記了8個(gè)特征峰，其歸屬關(guān)系為A（1、2）B（3）C（4、5）D（6）E（7、

5、8）F（30-35min成分群）。這為下一步組分群的藥效研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2．黑骨藤各組分群的藥效學(xué)優(yōu)選研究
　　此部分研究中，以上述富集的黑骨藤80%乙醇提取部位組分群為基礎(chǔ)，結(jié)合黑骨藤傳統(tǒng)藥效和現(xiàn)代化藥理活性研究進(jìn)展，選擇抗氧化活性（ABTS·+自由基清除能力、DPPH·自由基清除能力）、乙酰膽堿酯酶抑制活性、抗過(guò)敏活性、細(xì)胞毒性對(duì)其進(jìn)行藥效學(xué)優(yōu)選研究。結(jié)果顯示：ABTS·+自由基清除能力大小：E＞D＞B＞C＞A＞F

6、＞G；DPPH·自由基清除能力大?。篍＞F＞D＞C＞A＞B＞G；乙酰膽堿酯酶抑制活性大?。篍＞D＞F＞B＞A＞C＞G；體外抗過(guò)敏活性大小為E＞A＞C＞F＞B＞D＞G；對(duì)MH7A類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞毒性大小為E＞A＞B＞C＞D＞G＞F。課題組前期通過(guò)譜效關(guān)系研究推測(cè)的抗炎有效物質(zhì)峰為2、6、8號(hào)，包含于A（1、2）、D（6）E（7、8）中，在此部分試驗(yàn)中，證實(shí)了2、8號(hào)峰位于的A、E段擁有較好的活性；在體外抗氧化與體外乙酰膽堿酯酶抑制活性中，

7、E段的活性都為最強(qiáng)，因此，E段組分群可作為后續(xù)藥效物質(zhì)辨識(shí)研究的對(duì)象。
　　3．黑骨藤E段組分群藥效物質(zhì)辨識(shí)研究
　　此部分研究以活性最優(yōu)的E段組分群為對(duì)象，采用紫外吸收光譜法和高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行藥效物質(zhì)辨識(shí)研究。E段高效液相色譜圖中主要有5個(gè)特征峰，通過(guò)樣品與對(duì)照品紫外吸收波長(zhǎng)和高效液相色譜圖保留時(shí)間對(duì)比，指認(rèn)了兩個(gè)黃酮類化合物，分別是槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。

8、>　　4．黑骨藤總黃酮提取工藝研究
　　前述藥效學(xué)優(yōu)選出來(lái)活性最佳的E段組分群中含有黃酮類化合物，這為黑骨藤的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)參考。本項(xiàng)研究中，采用超
　　聲預(yù)處理微波提取技術(shù)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選出超聲預(yù)處理最佳時(shí)間25min，運(yùn)用中心組合（BBD）響應(yīng)面法，以黑骨藤總黃酮提取率為指標(biāo)優(yōu)化提取工藝參數(shù)：微波功率（W）、乙醇濃度（%）、液料比（mL·g-1）及微波時(shí)間（s），通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度59

9、.92%、液料比21.24mL·g-1、微波時(shí)間為209.53s、微波功率274.14W。在此工藝參數(shù)下，黑骨藤總黃酮提取率為9.11±0.08%，與微波提取法相比增加了14.30%，與超聲波提取法相比增加了19.86%；通過(guò)聚酰胺純化后，超聲預(yù)處理微波提取的黑骨藤總黃酮的抗過(guò)敏活性半抑制率為IC50=1.033mg·mL-1，分別優(yōu)于超聲提取法（IC50=12.913mg·mL-1）與微波提取法（IC50=1.762mg·mL-1）。