基于譜-效相關(guān)的雷公藤效-毒物質(zhì)初步研究.pdf

1、目的：
　　雷公藤藥效明確，但同時其毒性明顯，臨床應(yīng)用受到限制，本研究以其為研究對象，探討研究其抗炎效應(yīng)和肝損傷物質(zhì)基礎(chǔ)，為提升雷公藤類藥材質(zhì)量建立針對性的控制方法提供參考依據(jù)。
　　方法：
　　分別采集常用品種雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.和地方代用品種昆明山海棠Tripterygium hypoglaucum(Lévl.)Hutch藥材樣品共23批。
　　采用LC-Q/TO

2、F-MS技術(shù)表征不同產(chǎn)地雷公藤樣品的化學(xué)成分，液相方法:色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18600 Bar(1.8μm，2.1*100mm);流動相:A: CH3CN(0.1％ HCOOH), B: H2O(0.1％ HCOOH);流速:0.3 mL·min-1;進樣量:4μL;柱溫:30℃;樣品溫度:4℃;檢測波長:190-420nm;質(zhì)譜條件:離子源:ESI;毛細管電壓:4000 V;質(zhì)/核比范圍:

3、80-1000 m/z;脫溶劑氣溫度:225℃;脫溶劑氣流量:11 L/min;霧化器壓力:45 psig;鞘氣溫度:350℃;鞘氣流速:12 L/min;噴嘴電壓:500 V。并通過高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合文獻初步指認其中10種主要成分;采用藥典指紋圖譜相似度計算軟件，對全部藥材進行相似度分析，進一步進行了不同基原藥材之間的相似度分析，以探索各批次藥材化學(xué)成分總體差異;對初步指認的10種主要成分的豐度情況，采用SPSS軟件對每個樣品進行系統(tǒng)

4、聚類分析。
　　針對雷公藤肝細胞毒性和抗炎效應(yīng)，以正常人肝細胞（L02細胞系）為研究載體，對乙酰氨基酚為陽性藥，細胞抑制率為檢測指標，優(yōu)化建立肝細胞毒價檢測方法，評價不同產(chǎn)地雷公藤及其地方習(xí)用品昆明山海棠藥材的肝細胞毒價，以巨噬細胞(BMDM)為研究載體，柳氮磺吡啶為陽性藥，以驗證因子白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)和一氧化氮合成酶(iNOS)為指標，建立雷公藤體外抗炎效應(yīng)的檢測方法，評價不同雷公藤樣品的體外抗炎

5、效應(yīng)。
　　基于譜-效相關(guān)分析，將化學(xué)檢測和生物檢測技術(shù)相結(jié)合，采用簡單相關(guān)分析及多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法，分析雷公藤肝毒性和抗炎效應(yīng)成分，為其質(zhì)量控制提供可參考的依據(jù)。
　　結(jié)果：
　　(1)樣品采集與制備:本課題收集了兩種基原的23批雷公藤藥材，產(chǎn)地主要包括全國雷公藤的主產(chǎn)區(qū)，出膏率結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地藥材其出膏率差異較大。
　　(2)化學(xué)表征及指紋圖譜分析:從總體化學(xué)指紋圖譜上看，全部批次的雷公藤藥材化學(xué)成分差異較大

6、;不同基原、不同產(chǎn)地的雷公藤藥材化學(xué)成分差異不明顯;進一步通過高分辨質(zhì)譜結(jié)合文獻相關(guān)報道，從提取離子流圖初步指認了其中10種主要成分:雷公藤甲素(EIC+ M/Z:361.1641)，雷公藤堿戊(EIC+M/Z:780.2709)，雷公藤純堿(EIC+ M/Z:874.2764)，雷公藤內(nèi)酯(EIC+M/Z:313.1798)，雷公藤堿(EIC+ M/Z:884.2972)，雷公藤晉堿(EIC+M/Z:858.2815)，雷公藤次堿(E

7、IC+ M/Z:868.3022)，去甲基澤拉木醛(EIC+M/Z:481.2585)，雷公藤紅素(EIC+ M/Z:451.2848)，雷公藤酯甲(EIC+M/Z:455.3520);基于以上10種主要成分，采用SPSS軟件對樣品進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果顯示:其中8批Tripterygium wilfordii Hook.f.基原藥材能很好的聚為一類，說明10種主要成分在雷公藤（T.wilfordii）藥材中有一定的聚集度。另外關(guān)注5批

8、Tripterygium hypoglaucum(Lévl.)Hutch基原藥材，樣本之間不能聚為一類，說明上述10種各主要鑒定成分在昆明山海棠（T.hypoglaucum）藥材中的含量差異總體較大。
　　(3)生物效價和毒價:18份雷公藤樣品肝細胞毒價17.78～4131.4 U·g-1（相差超過200倍），5份昆明山海棠樣品肝細胞毒價209.42～7422.2 U·g-1（相差超過30倍），不同產(chǎn)地雷公藤及昆明山海棠藥材的肝細

9、胞毒價差異顯著;陽性藥柳氮磺吡啶可顯著降低BMDM細胞上清液中IL-6及iNOS的濃度，且顯著提高IL-10的濃度，從而表現(xiàn)出良好的抗炎效果。18份雷公藤樣品抑制IL-6的作用顯著強于陽性藥(P＜0.05)，7份雷公藤樣品促進細胞釋放IL-10的作用顯著強于陽性藥(P＜0.05)，16份雷公藤樣品抑制iNOS的作用顯著強于陽性藥(P＜0.05)。
　　(4)譜-效相關(guān)分析:通過毒價與10種主要成分的簡單相關(guān)分析，結(jié)果顯示:以相關(guān)系

10、數(shù)R＞0.80為指標，可初步確定雷公藤紅素、雷公藤甲素、去甲基澤拉木醛三個成分可能是雷公藤毒性較強的成分，其中雷公藤紅素與毒價的相關(guān)性最高;通過10種主要成分與毒價的主成分回歸分析，擬合的回歸模型中，R2=0.745，且有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.0049＜0.01。由回歸模型可知，變量雷公藤甲素具有較大的參數(shù)值，說明雷公藤甲素可能對雷公藤的毒性有較大的貢獻度;綜合簡單相關(guān)與多元回歸分析結(jié)果，初步認為雷公藤紅素和雷公藤甲素可能對雷公藤毒性

11、具有較大的貢獻。通過抑炎因子IL-10與10種主要成分的簡單相關(guān)分析，可初步確定10種主要成分與IL-10均無顯著相關(guān)性;通過10種主要成分與抑炎因子IL-10的主成分回歸分析，結(jié)果表明，擬合的回歸模型中，R2=0.4601，且有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.0.0154＜0.05。由回歸模型可知，雷公藤甲素、雷公藤晉堿具有較大的參數(shù)值，說明雷公藤甲素、雷公藤晉堿可能對雷公藤抗炎效應(yīng)有較大的貢獻度。
　　進一步結(jié)合初步發(fā)現(xiàn)的藥效和毒性成

12、分對23批雷公藤樣品的毒價和效應(yīng)進行綜合分析，篩選出“毒低效高”的樣品，包括5批雷公藤藥材，其基原均為雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.），其產(chǎn)地主要分布在西南地區(qū)。同時還篩選出“毒高效低”的樣品，包括源于安徽毫州及湖南岳陽的2批雷公藤藥材。
　　結(jié)論：
　　所建體外生物檢測方法能有效評價雷公藤肝細胞毒性和體外抗炎效應(yīng)差異;譜-效相關(guān)分析研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素既可能是毒性成分，又可能是抗炎效應(yīng)成