人參皂苷Rg3對魚藤酮誘導的PD模型多巴胺能神經(jīng)元的保護作用及其機制研究.pdf

1、帕金森病(PD)是一種常見于中老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理特征為黑質(SN)致密部多巴胺(DA)能神經(jīng)元的進行性變性死亡和路易氏小體(Lewy body, LB)的形成，引起黑質紋狀體通路中DA水平的降低，最終導致整個基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路功能的改變。患者大多表現(xiàn)為運動遲緩、肌肉僵直、震顫和步態(tài)不穩(wěn)等。PD發(fā)病機制復雜，一般認為可能與氧化應激、線粒體損傷、神經(jīng)免疫炎癥和神經(jīng)興奮性毒性有關。
　　人參皂苷Rg3(以下簡稱Rg3)是

2、中國傳統(tǒng)中藥人參的有效成分，Rg3能預防和治療癌癥、改善心臟血管功能、抗血小板凝集、保護腦神經(jīng)細胞和提高機體免疫力。本課題組前期研究表明，Rg3能減輕魚藤酮納米脂質載體(R-NLC)誘導的PD模型大鼠行為運動障礙，并能有效抑制黑質DA神經(jīng)元凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這一作用與Rg3減弱氧化應激反應、上調Bcl-2和Bax的比值以及抑制caspase通路激活有關。
　　作為上述工作的繼續(xù)，本實驗采用魚藤酮誘導PC12細胞損傷模型，用R-

3、NLC制備PD大鼠模型，從體內、體外兩條途徑，進一步確證人參皂苷Rg3對魚藤酮誘導的多巴胺能神經(jīng)元損傷的保護作用，著重探討p38 MAPK-iNOS-NO通路在其中的作用，以進一步探討Rg3保護DA能神經(jīng)元的分子生物學機制。主要結果如下:
　　1.人參皂苷Rg3對魚藤酮誘導的PD模型DA能神經(jīng)元的保護作用
　　方法:PC12細胞分組:(1)對照組:0.1％DMSO;(2)模型組:1μM魚藤酮;(3)1μM魚藤酮+0.3125

4、μM Rg3;(4)1μM魚藤酮+0.625μM Rg3;(5)1μM魚藤酮+1.25μM Rg3;(6)1μM魚藤酮+2.5μM Rg3;(7)1μM魚藤酮+5μM Rg3。Rg3溶液在魚藤酮前4小時加入，用MTT法測定24h各組細胞OD值，計算細胞存活率，流式細胞術測定細胞凋亡率。
　　動物分組:(1)對照組:sc空白NLC+ig0.5％ CMC-Na;(2)模型組:sc R-NLC+ig0.5％CMC-Na;(3)陽性藥物組

5、:sc R-NLC+ig司來吉蘭（11 mg/kg）;(4) Rg3低劑量組:sc R-NLC+igRg3(3mg/kg);(5) Rg3中劑量組:sc R-NLC+igRg3（6mg/kg）;(6) Rg3高劑量組:sc R-NLC+igRg3（12mg/kg）。大鼠皮下注射(sc)R-NLC，首劑量0.5mg/kg，第二次0.8mg/kg，此后每次1mg/kg，全程2天一次，共28天。其它藥物提前3天灌胃給藥，每天一次，共31天。末

6、次注射給藥后24h，分離大鼠黑質和紋狀體。以評分法考察大鼠行為學表現(xiàn)、HE染色觀察黑質細胞形態(tài)，高效液相-電化學法測定紋狀體DA含量。
　　結果:
　　(1)對PC12細胞損傷的影響:模型組OD值為0.340±0.007，細胞存活率為69.5％，0.3125、0.625、1.25、2.5、5μM Rg3組OD值分別為0.354±0.011(P＜0.05)，0.388±0.018(P＜0.01)，0.423±0.009(P＜0

7、.01)，0.441±0.007(P＜0.01)和0.416±0.007(P＜0.01)，細胞存活率分別為72.4％，79.3％，86.5％，90.3％和85.1％，與模型組比較有顯著升高。
　　(2)對PC12細胞凋亡的影響:魚藤酮使PC12細胞出現(xiàn)早期和晚期凋亡，總凋亡率達71.1％(P＜0.01)。1.25，2.5μM Rg3預處理后，細胞凋亡率下降為47.9％和28.1％。
　　(3)對PD大鼠外觀行為和DA能神經(jīng)元

8、的影響:①行為學評分:與模型組(3.83±3.13)評分比較，低、中、高劑量Rg3干預后，評分分別為1.57±0.98、1.57±0.98和1.43±1.13，呈顯著性降低。②黑質HE染色:與對照組相比，模型組大鼠黑質神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮，胞體縮小，胞內尼氏體明顯減少;Rg3干預后能明顯改善上述變化。③紋狀體DA含量:模型組紋狀體DA含量為0.57±0.11 nmol/g，較對照組（14.15±3.68nmol/g）顯著降低。低、中、高劑量

9、Rg3組DA含量分別為1.38±0.79 nmol/g(P＜0.05)、1.15±0.34nmol/g(P＜0.01)和9.49±6.93 nmol/g(P＜0.01)，與模型組比較，呈顯著升高。
　　結論:人參皂苷Rg3可抑制體內、外魚藤酮誘導的PD模型DA能神經(jīng)元損傷，并能抑制魚藤酮誘導的PC12細胞凋亡。
　　2.人參皂苷Rg3對魚藤酮誘導的PD模型DA能神經(jīng)元iNOS活力和NO含量的影響
　　方法:PC12細胞

10、分組:(1)對照組:0.1％DMSO;(2)模型組:1μM魚藤酮;(3)1μM魚藤酮+1.25μM Rg3;(4)1μM魚藤酮+2.5μM Rg3;大鼠分組和給藥方法同第一部分。比色法測定細胞和大鼠黑質iNOS活力和NO含量。
　　結果:
　　(1)細胞iNOS活力和NO含量:模型組iNOS活力和NO含量分別為0.692±0.030U/mL和7.67±1.45μM，與對照組（0.431±0.051U/mL和2.90±0.53

11、μM）比較，呈顯著升高;1.25、2.5μM Rg3組iNOS活力分別為0.636±0.031U/mL和0.643±0.009 U/mL，NO含量分別為4.84±1.20μM和4.91±1.72μM，與模型組比較，呈顯著下降。
　　(2)大鼠黑質iNOS活力和NO含量:模型組黑質iNOS活力和NO含量分別為0.223±0.044 U/mgprot和8.06±2.35μmol/gprot，與對照組（0.142±0.016U/mgpr

12、ot和4.57±1.30μmol/gprot)比較，呈顯著升高;低、中、高劑量Rg3組黑質iNOS活力分別為0.140±0.033U/mgprot，0.132±0.023 U/mgprot和0.145±0.035 U/mgprot，NO含量分別為5.26±1.18μmol/gprot，4.41±1.12μmol/gprot和5.40±1.03μmol/gprot，與模型組比較，呈顯著下降。
　　結論:人參皂苷Rg3能顯著抑制體內、

13、外魚藤酮誘導的iNOS活力增加和NO產(chǎn)生，提示Rg3可能通過抑制NO的生成來保護DA能神經(jīng)元。
　　3.人參皂苷Rg3對魚藤酮誘導的PD模型DA能神經(jīng)元p38 MAPK與NO的關系研究
　　方法:
　　(1)體外實驗:分組:(1)對照組:0.1％DMSO;(2)模型組:1μM魚藤酮;(3)1μM魚藤酮+10μM SB203580; MTT法測定細胞存活率，比色法測定iNOS活力和NO含量。
　　(2)體內實驗:大

14、鼠分組和給藥方法同第一部分。末次給藥后24h，Western blot法測定黑質中p-p38MAPK蛋白表達;免疫組化法測定p-p38MAPK和iNOS的表達，并對其進行非線性相關分析。
　　結果:
　　(1) p38 MAPK抑制劑SB203580對細胞存活率、iNOS活力和NO含量的影響:SB203580組細胞存活率為81.0％，較模型組(69.0％)顯著升高。模型組iNOS活力和NO含量分別為0.692±0.030 U

15、/mL和7.67±1.45μM，SB203580干預后，分別下降為0.634±0.014 U/mL和5.27±1.66μM。提示魚藤酮引起PD損傷的機制與p38MAPK有關，p38 MAPK通路可能調控了iNOS活力和NO水平。
　　(2)對p-p38MAPK表達的影響:與對照組相比，模型組黑質中p-p38 MAPK表達水平顯著增強，Rg3預處理后，p-p38 MAPK表達水平顯著降低，提示Rg3抗PD大鼠黑質DA能神經(jīng)元凋亡的作

16、用機制可能與下調p-p38 MAPK水平有關。
　　(3)p-p38MAPK和iNOS表達量的相關性分析:與對照組相比，模型組黑質中p-p38MAPK和iNOS陽性細胞百分數(shù)均有顯著升高;Rg3預處理后，兩種蛋白陽性細胞百分數(shù)都呈明顯降低。對兩種蛋白陽性細胞百分數(shù)進行相關性分析，表明p-p38 MAPK與iNOS呈正相關。提示Rg3可能是通過抑制p38 MAPK的磷酸化，從而減少iNOS的活化。
　　結論:Rg3可能是通過抑