靈芝酸A藥代動力學(xué)及靈芝潛在藥物相互作用研究.pdf

1、靈芝是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝（Ganoderma lucidum）.和紫芝（Ganoderma sinense）的子實體，靈芝三萜和多糖是靈芝的兩種主要藥理活性組分。靈芝酸A(Ganoderic acidA，GAA)是靈芝中含量最為豐富的三萜酸之一，普遍存在于靈芝屬植物中。研究報道顯示，GAA具有鎮(zhèn)痛、抗氧化、肝保護(hù)和抗癌等藥理活性。作為靈芝的主要活性成分，GAA單體的代謝、體內(nèi)藥代動力學(xué)特性和生物利用度仍鮮有報道。靈芝及其制劑

2、在臨床及日常保健中被廣泛應(yīng)用，常與其他處方藥物同時使用，其是否會和其他藥物發(fā)生藥物相互作用仍然缺乏相關(guān)的研究。本文以靈芝酸A為研究對象，從整體動物及細(xì)胞水平探討靈芝三萜在體內(nèi)的藥代動力學(xué)過程及吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制;以靈芝提取物為研究對象，考察靈芝是否存在基于外排轉(zhuǎn)運(yùn)體和細(xì)胞色素P450(CYP450)酶的潛在藥物相互作用，為靈芝的合理應(yīng)用和新藥研發(fā)提供依據(jù)。本論文完成的研究工作主要有以下幾個方面:
　　1.GAA代謝產(chǎn)物及代謝途徑研究采用

3、HPLC-DAD-MS/MS技術(shù)，首次鑒定了GAA的代謝產(chǎn)物，研究了其主要代謝產(chǎn)物的酶動力學(xué)特性。對靜脈給予大鼠GAA后采集到的生物樣品、以及GAA在大鼠和人肝微粒體孵育體系中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并對其主要代謝產(chǎn)物的酶動力學(xué)特性進(jìn)行考察。從大鼠膽汁、血漿和尿液中共檢測鑒定了37種代謝物;從體外大鼠肝微粒體(RLMs)孵育體系和人肝微粒體(HLMs)孵育體系中分別鑒定了與大鼠體內(nèi)相同的9和7種代謝物。研究提示GAA在人和大鼠體內(nèi)的代謝途徑

4、具有相似性。GAA可以發(fā)生氧化還原羥基化的Ⅰ相代謝和葡萄糖醛酸化磺酸化的Ⅱ相代謝反應(yīng)，其主要代謝位點(diǎn)為3、7、11、15、23位的羰基或羥基基團(tuán)和12、20、28(29)位的碳原子。GAA的還原代謝產(chǎn)物在RLMs中的生成速率遠(yuǎn)大于在HLMs中，且均由CYP3A參與代謝。
　　2.GAA及其代謝產(chǎn)物體內(nèi)藥代動力學(xué)研究首先建立了靈敏的用于測定大鼠血漿、膽汁、尿液和腦微透析液中GAA濃度的UFLC-MS/MS分析方法。方法學(xué)考察顯示，該

5、方法線性良好、靈敏可靠，具有低的檢測限(0.25nmol/L)和定量限(2.00nmol/L)，精密度、準(zhǔn)確度、萃取回收率、穩(wěn)定性等均能滿足生物樣品分析要求。用所建立的分析方法研究GAA及其主要代謝物靈芝酸C2(C1)、7β，11，15-trihydroxy-3,23-dioxo-lanost-8-en-26-oic acid(C2)、11,15-dihydroxy-3,7,23-trioxo-lanost-8-en-26-oic ac

6、id(C3)和靈芝酸B(C4)在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)特性。代謝物濃度以GAA標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。靜脈給予GAA(20mg/kg)后，原型藥在體內(nèi)逐漸消除，同時生成了豐富的代謝物C1-C4。各代謝物在5min左右均達(dá)到Cmax值，分別為2.61、0.17、2.84和0.51μmol/L，且C1、C2、C4在3-6h左右有明顯的重吸收峰。GAA及其代謝物C1-C4的t1/2分別為2.40、13.08、12.35、2.16和2.79h，并主要從膽

7、汁中排出，0-24h在膽汁中的累積排泄率分別為給藥劑量的21.37％、18.02％、2.22％、2.33％和0.70％。而GAA在尿液中的累積排泄率僅為2.59％，代謝物C1-C4的累積排泄率之和為0.076％?？诜o藥（20mg/kg）后，GAA原型藥和四個代謝物C1-C4在10-40min出現(xiàn)第一個血藥濃度峰值，且在6-8h左右均出現(xiàn)重吸收峰。GAA的口服生物利用度為8.68％。靜脈給藥方式下，GAA可快速通過血腦屏障(Tmax，0

8、.25h)進(jìn)入腦組織，其血腦屏障透過率為2.96％，在腦透析液中未檢測到其代謝物C1-C4。
　　3.GAA腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究采用Caco-2細(xì)胞模型，以UFLC-MS/MS分析方法首次研究了GAA的腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。結(jié)果表明，GAA在不同濃度(25、50、100μg/mL)下從腸腔側(cè)(AP)到基底側(cè)(BL)和從BL側(cè)到AP側(cè)的通透量隨濃度和時間的增加而相應(yīng)增加，表觀滲透系數(shù)PappA→B為(4.30-4.99)×10-7cm/s

9、，PappB→A為(33.52-37.77)×10-7cm/s，外排率為6.72-8.79。在P-糖蛋白(P-gp)抑制劑維拉帕米，多藥耐藥蛋白(MRP)抑制劑MK571和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）抑制劑潘生丁的干預(yù)下，GAA的PappA→B值分別升高至5.79×10-7、12.14×10-7和4.62×10-7cm/s，Papp B→A值分別降低至30.17×10-7、23.55×10-7和25.57×10-7cm/s，外排顯著降低。

10、提示P-gp、MRP和BCRP均參與GAA的外排轉(zhuǎn)運(yùn)，這可能是GAA口服生物利用度低的主要原因。
　　4.基于外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的靈芝潛在藥物相互作用研究通過Caco-2細(xì)胞攝取和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實驗，研究靈芝（Ganoderma lucidum）提取物及單體成分GAA對外排轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp、MRP和BCRP功能的影響。細(xì)胞攝取實驗結(jié)果顯示，靈芝總提物(GLE)和靈芝三萜提取物(GLT)在濃度為100μg/mL時，使P-gp底物羅丹明123（Rho

11、）和MRP底物鈣黃綠素(Cal)的攝取量顯著增加，對P-gp和MRP功能表現(xiàn)出抑制作用;使BCRP的底物Hoechst33342(Hoe)的攝取量顯著降低，對BCRP功能表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用。靈芝多糖提取物(GLP)在實驗濃度下則對P-gp和MRP功能無顯著影響，在濃度為100μg/mL時對BCRP表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用。GAA在實驗濃度下對P-gp、MRP和BCRP功能均無顯著影響。Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型實驗中，用不同濃度GLE和GLT干預(yù)Rho

12、的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)時，Rho從AP到BL的通透量和Papp A→B值均顯著增加，從BL到AP的通透量和PappB→A值均顯著降低，且表現(xiàn)出劑量依賴性，提示GLE和GLT可以抑制P-gp的外排作用。用不同濃度GLE和GLT干預(yù)Cal的外排時，Cal在AP側(cè)的通透量表現(xiàn)出不同程度的降低，在Caco-2細(xì)胞單層膜中的累積量表現(xiàn)出不同程度的增加，提示GLE和GLT可以抑制MRP的外排作用。靈芝三萜是靈芝發(fā)揮外排轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制作用的主要活性成分。提示靈芝在與

13、外排轉(zhuǎn)運(yùn)體底物藥物合并使用時，可能存在藥物相互作用風(fēng)險。
　　5.基于CYP450酶的靈芝潛在藥物相互作用研究選擇臨床常用藥物非那西丁、奧美拉唑、右美沙芬、睪酮、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗分別作為CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9和CYP2E1的探針底物，結(jié)合UFLC-MS/MS技術(shù)對底物代謝物進(jìn)行檢測，以Cocktail探針底物肝微粒體代謝反應(yīng)體外評價方法，對靈芝提取物和其主要成分GAA的CYP45

14、0酶抑制活性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，在HLMs中，GLE對CYP2C19、2D6、3A4和2C9表現(xiàn)出微弱的抑制作用，IC50值分別為131.2、164.4、150.5和142.2μg/mL。GLT的抑制作用略強(qiáng)于GLE，IC50值分別為102.5、116.1、136.4和82.2μg/mL。GLP對6種CYP450酶抑制作用均不明顯。在RLMs中，GLT對CYP2C9表現(xiàn)出微弱的抑制作用，IC50值為163.1μg/mL，而對其他酶活性無