基于組合質(zhì)譜技術(shù)的新型抗結(jié)核組合藥物臨床前藥代動力學(xué)與代謝相互作用研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的單一致病菌慢性傳染性疾病，已成為繼HIV/AIDS后世界上威脅人類生命健康的第二大疾病。2013年全球結(jié)核病新增發(fā)病人數(shù)為900萬，死亡人數(shù)為150萬。目前結(jié)核病臨床治療多采用聯(lián)合用藥的方式預(yù)防耐藥結(jié)核病的發(fā)生，但服用藥物多，服藥周期長，毒副作用強(qiáng)，成本高是現(xiàn)行主流療法面臨的重大難題。本文基于前期反饋系統(tǒng)控制技術(shù)(FSC)對已有抗結(jié)核藥物進(jìn)行篩選和組合的

2、基礎(chǔ)上，較為全面地研究了新型抗結(jié)核組合藥物EMB、PZA、CLZ和PRO在SD大鼠和Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征及體內(nèi)吸收、代謝方面可能存在的藥物相互作用，為新型抗結(jié)核組合藥物在臨床上的應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。
　　一、標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核組合藥物定量分析方法的建立和臨床前藥代動力學(xué)研究
　　WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核組合藥物包括RFP、INH、EMB和PZA，文獻(xiàn)多采用LC-MS/MS方法進(jìn)行四個(gè)藥物的藥代動力學(xué)研究及其臨床治療藥物監(jiān)測

3、。四個(gè)藥物極性差別較大，給同時(shí)定量測定帶來極大困難。本章通過考察不同液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的適用性，色譜柱的選擇，梯度洗脫程序的優(yōu)化，克服了EMB和INH的基質(zhì)干擾，建立了一個(gè)靈敏度高、特異性好、重現(xiàn)性好的LC-MS/MS方法同時(shí)對SD大鼠和Beagle犬血漿中的上述四種藥物進(jìn)行定量分析。血漿樣品經(jīng)乙腈蛋白沉淀后，上清液采用Waters Atlantis dC18色譜柱，以甲醇∶乙腈(1∶1，v/v)為有機(jī)相、0.1％甲酸水溶液為水相進(jìn)行快

4、速梯度洗脫，四個(gè)藥物和內(nèi)標(biāo)4min內(nèi)洗脫完全且色譜峰型良好，單個(gè)樣品分析周期為6min。SD大鼠和Beagle犬血漿中上述四種藥物定量分析方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果符合FDA關(guān)于生物樣品分析的相關(guān)規(guī)定，該方法被成功地應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核組合藥物在SD大鼠和Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究中。
　　二、新型抗結(jié)核組合藥物定量分析方法的建立和SD大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究
　　本章在前一章分析方法研究的基礎(chǔ)上，建立了一個(gè)LC-MS/MS方法對新

5、型抗結(jié)核組合藥物中EMB、PZA、CLZ和PRO同時(shí)進(jìn)行定量分析。20μL血漿樣品采用Sirocco96孔蛋白沉淀板進(jìn)行快速、高通量的分離純化，隨后在Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱上，以甲醇和5mM醋酸銨+0.1％甲酸水溶液為流動相梯度洗脫，四個(gè)藥物和內(nèi)標(biāo)7min內(nèi)洗脫完全且色譜峰型良好，單個(gè)樣品分析周期為10min。SD大鼠血漿中上述四種藥物定量分析方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果符合FDA關(guān)于生物樣品分析的相關(guān)規(guī)定，該方法被成功地應(yīng)用

6、于新型抗結(jié)核組合藥物在SD大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)及其相互作用研究中。
　　對比分析SD大鼠單劑量給四個(gè)單藥和新型抗結(jié)核組合藥物后四個(gè)藥物的主要藥代動力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合給藥后可能會延緩EMB在SD大鼠體內(nèi)的吸收，促進(jìn)PRO的吸收，但兩者的t1/2和MRT均無明顯差異，說明聯(lián)合給藥對大鼠腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生影響，但對藥物的消除影響不大。CLZ和PZA的藥代動力學(xué)參數(shù)無明顯差異，提示聯(lián)合給藥后對兩者無明顯藥物相互作用。SD大鼠多劑量給藥四個(gè)單藥

7、及其組合藥物第五天后，體內(nèi)四個(gè)藥物的血藥濃度均已基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)。通過分析對比單劑量和多劑量給四種單藥及組合藥物后四個(gè)藥物的藥代動力學(xué)參數(shù)可以看出，連續(xù)給藥七天后四個(gè)藥物在SD大鼠體內(nèi)均有蓄積，但是tmax，t1/2和MRT值無明顯差異，說明藥物在體內(nèi)的蓄積不會影響機(jī)體代謝特征。
　　三、新型抗結(jié)核組合藥物在Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究
　　為了進(jìn)一步了解新型抗結(jié)核組合藥物的臨床前藥代動力學(xué)特征，本章沿用第三章的LC-MS

8、/MS法結(jié)合Sirocco96孔蛋白沉淀板樣品前處理的方法對新型抗結(jié)核組合藥物在Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究和及其相互作用進(jìn)行考察。通過分析單藥和組合藥物的單劑量實(shí)驗(yàn)后Beagle犬體內(nèi)四個(gè)藥物的藥代動力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合給藥后會延緩機(jī)體對EMB的吸收，促進(jìn)CLZ的吸收，但是對PRO的吸收會有抑制，對PZA無明顯影響。多劑量給新型抗結(jié)核組合藥物第五天開始，Beagle犬體內(nèi)EMB、PZA和CLZ的血藥濃度已基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)。通過分析單劑

9、量和多劑量給組合藥物后四個(gè)藥物的藥代動力學(xué)參數(shù)，表明連續(xù)七天給藥后PZA和PRO均無明顯的蓄積，藥代動力學(xué)參數(shù)無明顯差異，說明連續(xù)給藥七天不影響PZA和PRO在機(jī)體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征。而EMB和CLZ在Beagle犬體內(nèi)有明顯的蓄積，但tmax，t1/2和MRT值無明顯差異，說明這兩個(gè)藥物在Beagle犬體內(nèi)的蓄積不會影響機(jī)體代謝特征。
　　四、新型抗結(jié)核組合藥物對SD大鼠肝微粒體主要藥物代謝酶活性的影響
　　本章采用LC-

10、UV方法對SD大鼠肝微粒體中三種主要藥物代謝酶的特異性探針底物非那西丁(CYP1A2)、咪達(dá)唑侖(CYP3A4)和氯唑沙宗(CYP2E1)及其主要代謝產(chǎn)物對乙酰氨基酚、1'-羥基咪達(dá)唑侖和6-羥基氯唑沙宗進(jìn)行測定，考察了SD大鼠分別連續(xù)給EMB、PZA、CLZ、PRO單藥和新型抗結(jié)核組合藥物14天后對上述三種代謝酶活性的影響。
　　通過與空白組相比發(fā)現(xiàn):對于CYP1A2而言，SD大鼠連續(xù)14天給藥EMB后對CYP1A2無明顯作用，

11、PZA、CLZ、PRO以及組合藥物組對CYP1A2存在誘導(dǎo)作用;SD大鼠性別之間沒有差異。對于CYP3A4而言，SD大鼠分別連續(xù)14天給四個(gè)單藥以及組合藥物后對CYP3A4均無明顯作用;但SD大鼠表現(xiàn)出性別差異。對于CYP2E1而言，SD大鼠分別連續(xù)14天給藥PZA、CLZ、PRO、EMB后對CYP2E1均無明顯作用，而組合藥物組對CYP2E1存在誘導(dǎo)作用;SD大鼠性別之間沒有差異。CYP1A2參與了咖啡因、茶堿等20多種藥物的代謝，新