骨髓間充質(zhì)干細胞促進小鼠異基因臍血移植后造血重建及減經(jīng)GVHD的研究.pdf

1、目的:體外培養(yǎng)鑒定小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC),構(gòu)建小鼠臍血移植模型,研究聯(lián)合輸注骨髓間充質(zhì)于細胞對受鼠造血功能恢復(fù)及對急性移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的作用。
　　 方法:體外采用全骨髓法培養(yǎng)擴增小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,通過流式細胞術(shù)(FCM)鑒定細胞表型及在成骨成脂培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)后發(fā)育為骨組織和脂肪組織來鑒定MSC。構(gòu)建小鼠異基因

2、臍血移植及GVHD模型,實驗分為五組:A組:單純照射組;B組:臍血移植組(Allo-UCBT組):每只小鼠照射后經(jīng)尾靜脈注射供鼠2×106臍血單個核細胞懸液;C組:Allo-UCBT+MSC組,每只小鼠照射后經(jīng)尾靜脈注射供鼠2×106臍血單個核細胞懸液+2×107個MSC;D組:Allo-UCBT+脾細胞組,每只小鼠照射后經(jīng)尾靜脈注射供鼠2×106臍血單個核細胞懸液+供鼠2×106個脾細胞懸液;E組:Allo-UCBT+脾細胞+MSC組

3、,每只小鼠照射后經(jīng)尾靜脈注射供鼠2×106臍血單個核細胞懸液+供鼠2×106個脾細胞懸液+2×107個MSC。移植后不同時間點檢測小鼠外周血白細胞,紅細胞、血小板變化,并用流式細胞儀鑒定受鼠嵌合率,評價其造血恢復(fù)情況;通過受鼠GVHD臨床積分、組織病理學(xué)改變等變化評價MSC對急性GVHD的作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、應(yīng)用全骨髓法在體外成功培養(yǎng)擴增C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,細胞表面標志測定為CD44+CD90

4、.2+CD34-CD45-;成骨誘導(dǎo)后礦鹽沉積,形成小片狀結(jié)節(jié),茜素紅染色呈紅色;成脂誘導(dǎo)后細胞內(nèi)有小脂滴出現(xiàn);2周后脂滴數(shù)量增加并相互融合,細胞由長梭形變?yōu)閳A形或多邊形,油紅O染色顯示有大量脂質(zhì)沉積。
　　 2、異基因臍血移植成功的最低臍血單個核細胞數(shù)為2×106,低于2×106個小鼠均于10 d內(nèi)死于造血衰竭。C組小鼠骨髓抑制期較短,白細胞、紅細胞、血小板在移植后第6 d即開始上升,造血恢復(fù)明顯加快。嵌合體檢測顯示受鼠體內(nèi)供

5、者來源細胞在第4 d高達(22.87±4.3)％,與B組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。C組小鼠平均存活時間為(25.0±10.55)d,而B組平均生存率為(15.5±12.5) d。
　　 3、D組受鼠一般狀態(tài)差,于移植后+13 d出現(xiàn)倦怠,食欲下降,消瘦,弓背,皮毛紊亂、無光澤,活動度重度下降,約1/2小鼠出現(xiàn)皮膚潰瘍、腹瀉等急性GVHD表現(xiàn),20 d內(nèi)全部死亡,皮膚、肝臟和小腸組織病理學(xué)檢查達到ThomasGVHD病