調(diào)控溫度敏感的TRP通道改善線粒體功能障礙防治血管損傷的機(jī)制.pdf

1、背景和目的:高血壓和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是臨床的常見(jiàn)病和多發(fā)病，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)高鹽、高脂和高糖等不健康飲食以及寒冷氣候是導(dǎo)致心血管病發(fā)生和加重的危險(xiǎn)環(huán)境因素。其中寒冷氣候是導(dǎo)致高血壓的重要環(huán)境因素，且不易改變。冬季心腦血管發(fā)病率及相關(guān)事件顯著增加，寒冷應(yīng)激導(dǎo)致心血管系統(tǒng)的改變以血壓升高為主，可導(dǎo)致寒冷性高血壓(cold-induced hypertension，CIH)。而高脂飲食會(huì)引起血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬

2、化的發(fā)生。因此，闡明環(huán)境因素導(dǎo)致血管損傷的機(jī)制對(duì)高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化的防治有重要意義。
　　線粒體功能障礙導(dǎo)致的血管氧化應(yīng)激損傷是引起高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的重要病理生理基礎(chǔ)。線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能協(xié)同調(diào)節(jié)胞漿和線粒體的鈣離子(Ca2+)濃度，胞漿鈣離子濃度增加能升高線粒體鈣離子濃度。細(xì)胞內(nèi)鈣超載伴隨ROS的產(chǎn)生增加。血管緊張素Ⅱ和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)干預(yù)會(huì)損傷線粒體呼吸功能導(dǎo)致ROS生成大量增加。線粒體功能異常是導(dǎo)致細(xì)

3、胞氧化應(yīng)激損傷的主要原因，其中Ca2+內(nèi)流增加起關(guān)鍵作用。在血管平滑肌細(xì)胞線粒體ROS可激活胞膜上的L-型Ca2+通道促進(jìn)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，激活RhoA和Rho激酶信號(hào)通路，進(jìn)一步促進(jìn)血管平滑肌收縮增加血管張力。血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS過(guò)量生成會(huì)導(dǎo)致一氧化氮生物利用度降低，損傷血管功能。使用線粒體特異性的ROS清除劑能有效降低ROS水平并改善上述病理生理改變。
　　瞬時(shí)受體電位通道[Transient receptor potenti

4、al(TRP) channels]是一類(lèi)非選擇性陽(yáng)離子通道超家族，在哺乳動(dòng)物不同組織細(xì)胞廣泛表達(dá)。TRP通道有分為T(mén)RPCs、TRPVs、TRPPs和TRPMs等多個(gè)亞型。其中Trpm8和Trpv1對(duì)溫度敏感，又被稱(chēng)為溫度敏感性TRP通道(Thermo-TRPs)。Trpm8能被10℃～23℃的寒冷溫度及薄荷醇激活介導(dǎo)冷感覺(jué)，故Trpm8又稱(chēng)為冷通道。Trpv1可被高于43℃的溫度及食物中的辛辣刺激成分激活辣椒素激活，故Trpv1又稱(chēng)為

5、辣椒素受體。近年研究發(fā)現(xiàn)激活Trpm8/v1在調(diào)控細(xì)胞Ca2+信號(hào)中起重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)棕色脂肪有大量Trpm8表達(dá)，激活血管組織Trpm8能抑制血管收縮反應(yīng)，長(zhǎng)期薄荷醇膠囊干預(yù)能顯著降低高血壓前期受試者的血壓及改善血管舒張功能，且心率也有降低。激活Trpv1可激活Ca2+敏感的PKA調(diào)節(jié)eNOS活性，促進(jìn)NO生成改善血管功能。我們及他人既往研究提示激活Trpm8或Trpv1可調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體功能，改善高鹽、

6、高糖等環(huán)境代謝因素導(dǎo)致的心血管損傷中起著重要的作用。因此，我們推測(cè)激活Trpm8可通過(guò)改善血管平滑肌細(xì)胞線粒體功能拮抗寒冷導(dǎo)致的血管功能障礙和高血壓;激活Trpv1可緩解ox-LDL導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能障礙。
　　本研究分兩部分進(jìn)行。第一部分為激活Trpm8調(diào)控線粒體功能拮抗寒冷性高血壓的機(jī)制研究。第二部為激活Trpv1改善ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮線粒體功能障礙的研究。探討了膳食因子激活TRP通道在拮抗環(huán)境因素導(dǎo)致的心血管損傷中

7、的作用。
　　材料方法:
　　本研究由離體和在體兩部分實(shí)驗(yàn)組成。離體實(shí)驗(yàn)以原代小鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞、胸主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象。在體實(shí)驗(yàn)采用寒冷(4℃冷刺激24周，每天干預(yù)4小時(shí))和血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)（0.7 mg/kg per day，14天）的C57BL/6J背景的野生型(wild type，WT)和Trpm8基因敲除（Trpm8-/-）小鼠建立高血壓小鼠模型，給予普通飼料（普食組）或0.5％的

8、薄荷醇飼料（薄荷醇組）喂養(yǎng)。
　　1.原代培養(yǎng)小鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，用免疫熒光和蛋白免疫印跡檢測(cè)Trpm8在血管平滑肌細(xì)胞的定位，以及Trpv1在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的定位。結(jié)合超速離心和測(cè)鈣鑒定血管平滑肌細(xì)胞Trpm8在肌漿網(wǎng)的表達(dá)及功能。
　　2.建立寒冷性高血壓小鼠模型和血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓小鼠模型，給予普通飼料或薄荷醇飼料喂養(yǎng)。采用鼠尾血壓測(cè)量方法監(jiān)測(cè)小鼠鼠尾血壓變化。干預(yù)結(jié)束后應(yīng)用無(wú)線遙測(cè)信號(hào)檢測(cè)小鼠24小時(shí)動(dòng)

9、態(tài)血壓。
　　3.采用小動(dòng)物超聲檢測(cè)小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能。進(jìn)行跑臺(tái)耐力測(cè)試（15°斜坡）檢測(cè)小鼠心臟功能。干預(yù)結(jié)束后處死取胸主動(dòng)脈檢測(cè)ROS生成情況;分離腸系膜動(dòng)脈檢測(cè)血管功能的變化。
　　4.應(yīng)用鈣指示劑檢測(cè)薄荷醇和血管緊張素Ⅱ干預(yù)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞胞漿鈣和線粒體鈣的影響。
　　5.應(yīng)用ROS熒光指示劑檢測(cè)薄荷醇和血管緊張素Ⅱ干預(yù)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞ROS生成的影響;以及辣椒素和ox-LDL處理對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平的影響

10、
　　6.采用高分辨率呼吸測(cè)定儀檢測(cè)薄荷醇和血管緊張素Ⅱ干預(yù)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞線粒體呼吸鏈氧化磷酸化功能和ROS生成的影響。
　　7.采用高分辨率呼吸測(cè)定儀檢測(cè)辣椒素和ox-LDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體呼吸鏈氧化磷酸化功能的影響。采用JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位。
　　8.蛋白免疫印跡法檢測(cè)薄荷醇和血管緊張素Ⅱ?qū)ρ芷交〖?xì)胞RhoA/Rho激酶信號(hào)通路相關(guān)蛋白（RhoA、RhoA-GTP、MYPT-1、p-MYPT-1、M

11、LC、p-MLC）表達(dá)的影響。
　　9.蛋白免疫印跡法檢測(cè)辣椒素和ox-LDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞PKA/UCP2信號(hào)號(hào)通路相關(guān)蛋白及線粒體蛋白（PKA、p-PKA、UCP2和NDUFA9）表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.Trpm8在血管平滑肌細(xì)胞胞膜和肌漿網(wǎng)有表達(dá)，激活Trpm8可介導(dǎo)肌漿網(wǎng)鈣釋放增加線粒體鈣攝取。
　　2.血管緊張素Ⅱ可導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞線粒體呼吸功能障礙及ROS大量生成，激活L-型Ca2+通道介

12、導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流增加，促進(jìn)線粒體Ca2+攝取增加。
　　3.薄荷醇激活血管平滑肌細(xì)胞Trpm8可減少ROS生成，抑制L-型Ca2+通道介導(dǎo)的細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和線粒體Ca2+攝取，改善血管緊張素Ⅱ?qū)е碌木€粒體功能受損，而對(duì)Trpm8-/-血管平滑肌細(xì)胞無(wú)效。
　　4.薄荷醇激活血管平滑肌細(xì)胞Trpm8可抑制血管緊張素Ⅱ上調(diào)RhoA-GTP/RhoA、p-MYPT-1/MYPT-1和p-MLC/MLC比值的作用，而對(duì)Trp

13、m8-/-血管平滑肌細(xì)胞無(wú)效。
　　5.長(zhǎng)期薄荷醇膳食干預(yù)能減少血管組織ROS的生成及RhoA-GTP/RhoA、p-MYPT-1/MYPT-1和p-MLC/MLC比值的升高，而對(duì)Trpm8-/-小鼠無(wú)效。
　　6.辣椒素激活血管內(nèi)皮細(xì)胞Trpv1能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞線粒體呼吸功能降低和ROS生成增加，使用Trpv1的抑制劑iRTX，PKA抑制劑KT5720或UCP2抑制劑Genipin抑制可阻斷辣椒素的作用。<

14、br>　　7.辣椒素可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞p-PKA/PKA、UCP2和NDUFA9的表達(dá)，使用Trpv1抑制劑iRTX，PKA抑制劑KT5720或UCP2抑制劑Genipin抑制可阻斷辣椒素的作用。
　　結(jié)論:
　　1.溫度敏感的Trpm8在血管平滑肌細(xì)胞胞膜和肌漿網(wǎng)均有表達(dá)，激活Trpm8可改善血管線粒體功能。
　　2.激活溫度敏感的Trpm8可改善冷應(yīng)激或血管緊張素Ⅱ?qū)е碌难芄δ苁軗p，降低血壓。
　　3.激活