半枝蓮抗腫瘤活性成分篩選及AhR基因敲除的肝癌細胞的初步構建.pdf

1、人體約80％～90％的腫瘤是由化學致癌物引起的?；瘜W致癌物在進入體內后，要受到體內各種酶的代謝，Ⅱ相酶在防治腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關重要的作用。半枝蓮中黃酮類化合物能很好的清除體內的自由基，起到抗腫瘤的作用。課題組前期工作發(fā)現(xiàn)半枝蓮黃酮類化合物能誘導Ⅱ相代謝酶的表達，但半枝蓮黃酮類化合物種類眾多，對于各化合物的作用及其機理仍未明確。因此，我們開展了對半枝蓮黃酮類化合物活性成分及其機理的進一步研究。
　　第一部分 ARE調控的綠色

2、熒光蛋白報告基因細胞對半枝蓮不同極性部位的黃酮類化合物篩選
　　目的:
　　通過ARE（anti-oxidative response element，抗氧化反應元件）調控的綠色熒光蛋白報告基因細胞模型來篩選半枝蓮7個不同極性部位的黃酮類化合物(A、B、C、D、E、F、G)，初步探討半枝蓮黃酮類化合物活性成分。
　　方法:
　　使用終濃度為50μg/mL的黃酮類化合物(A、B、C、D、E、F、G)以及終濃度為10

3、0μM的tBHQ（tertiary butylhydroquinone，叔丁基對苯二酚）分別對ARE調控的綠色熒光蛋白報告基因細胞Hep G2-4ARE-TK-GFP處理24小時后檢測細胞內GFP(Greenfluorescent protein，綠色熒光蛋白)相對發(fā)光強度。并檢測陽性黃酮類化合物G的劑量效應。
　　結果:
　　黃酮類化合物G顯示結果為陽性，相對熒光強度為1.97倍，而黃酮類化合物A、B、C、D、E、F均為陰

4、性。黃酮類化合物G濃度在80μg/mL時取得最大活性。結論:本實驗對前期提取的7個不同半枝蓮黃酮類化合物進行篩選，其中黃酮類化合物G為其主要活性成分。
　　第二部分 AhR基因敲除HepG2細胞模型的的初步構建
　　目的:
　　通過CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats—CRISPRassociated system，C

5、RISPR-Cas9基因編輯技術)基因打靶技術敲除Hep G2(Humanhepatocellular hver carcinoma cell line，人肝癌細胞系)內的AhR（aryl hydrocarbon receptor，芳香烴受體）基因，驗證其可行性，為進一步構建AhR基因缺失的ARE調控的綠色熒光蛋白報告基因細胞Hep G2-4ARE-TK-GFP提供基礎
　　方法:
　　針對AhR基因設計了三個sgRNA（s

6、mall guide RNA，引導RNA）位點，合成其對應的oligo雙鏈DNA后與線性的載體GV392連接后構建AHR-sgRNA載體。對構建的載體進行慢病毒包裝后對培養(yǎng)的Hep G2細胞進行轉染。將轉染陽性結果抽提DNA后PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應）擴增，使用錯配酶法檢測sgRNA活性
　　結果:
　　對AHR-sgRNA載體測序結果中找到了相應的sgRNA序列，在隨后的感

7、染后HepG2細胞內sgRNA活性的檢測中，三個sgRNA均表現(xiàn)出了活性，其中sgRAN3的活性最強。
　　結論:
　　本實驗利用CRISPR-Cas9基因打靶技術成功敲除了Hep G2細胞內的AhR基因，成功構建了AhR基因缺失的Hep G2細胞，驗證了使用CRISPR-Cas9基因打靶敲除Hep G2細胞內AhR基因的可行性，對下一步構建Nrf2/Keap1（nuclear factor erythroid-2p45-r