電針對腦缺血大鼠腦皮層血管內(nèi)皮生長因子介導血管新生的機制研究.pdf

1、目的: 缺血性中風具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高、復發(fā)率高的特點，是中老年人的多發(fā)病、常見病。隨著對缺血性腦卒中研究的深入，發(fā)現(xiàn)腦缺血后相當部分的血管能自然再通或溶栓治療后血流恢復再通，但隨之出現(xiàn)再灌注損傷。治療性血管生成(therapeutic angiogenesis，TAG)方法的出現(xiàn)，為缺血性腦血管病的治療開辟了一條通向缺血性腦血管病血管再生的新途徑。因此，適當?shù)卣{(diào)控治療性血管生成的進程對有效的改善腦缺血很有必要。血管

2、內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是已知的促進血管生長作用最強的細胞因子，VEGF/VEGFR 系統(tǒng)激活使內(nèi)皮細胞增生并誘導新生血管形成，新生血管從正常腦組織向半暗帶及缺血中心區(qū)延伸，增加受累腦組織再灌注及供氧量，從而減輕缺血再灌注損傷。針刺對缺血性腦損傷具有多水平、多通道、多靶點的保護和干預作用。本課題選用大腦中動脈栓塞制備腦缺血模型，觀察電針對VEGF介導的腦內(nèi)微血管新生的

3、信號轉(zhuǎn)導的影響，探討針刺治療抗腦缺血再灌注損傷的可能機制。 方法: 采用SD大鼠隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組(缺血0.5h再灌注1d、2d、4d、8d四個亞組)、電針組(缺血0.5h再灌注1d、2d、4d、8d加電針四個亞組)，前兩組每組各18只，后兩組每個亞組各18只。參照Longa報道的線栓法加以改進，制備大腦中動脈線栓法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)腦缺血再灌

4、注模型。神經(jīng)功能障礙評分參照Zea-Longa 5級4分評分標準，只有神經(jīng)功能障礙在1級以上的大鼠才能保留下來。電針“百會”、“水溝”、雙側(cè)“足三里”穴。分別運用電鏡觀察各組大鼠右側(cè)大腦皮層微血管內(nèi)皮的超微結(jié)構(gòu)變化，運用免疫組化SABC法檢測各組大鼠右側(cè)大腦皮層微血管的密度；運用RT-PCR法檢測各組大鼠右側(cè)大腦皮層中 VEGF mRNA 的表達水平；運用Westernblot 法檢測各組大鼠右側(cè)大腦皮層中 p-Akt、PTEN 的蛋白

5、含量；運用免疫組化 SABC 法檢測各組大鼠右側(cè)大腦皮層中微血管內(nèi)皮細胞 cyclinD1、caspase9陽性表達。所有數(shù)據(jù)均輸入計算機，以SPSS11.0軟件統(tǒng)計包處理，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差表示。 結(jié)果: (1)電針可以減輕神經(jīng)功能缺損(p<10.05，p<9.01)；可有效改善腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)大腦皮層組織的病理學改變；可明顯增加腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)大腦皮層的微血管密度(p<0.01)。 (2)模型

6、各組大鼠缺血側(cè)大腦皮層VEGFmRNA 表達明顯升高，與正常對照組、假手術(shù)組比較有顯著性差異(P<0.05、P<0.01)，其中在腦缺血再灌注2d達高峰；電針組各組VEGF mRNA表達水平均有所增強，與相應時相的模型組相比有顯著性差異(P<0.01)。 (3)模型組大鼠右側(cè)皮層p-Akt蛋白的含量升高，PTEN蛋白的含量略有升高，其中于腦缺血再灌注1d時右側(cè)皮層p-Akt蛋白的含量達高峰，缺血側(cè)PTEN蛋白的含量在腦缺血再灌注

7、2d升高幅度最大；電針組大鼠右側(cè)皮層p-Akt蛋白在腦缺血再灌注1d、2d、4d時，右側(cè)皮層p-Akt蛋白的含量明顯升高，與同時相的模型組相比較有顯著性差異(P<0.05)，但在腦缺血再灌注8d時，右側(cè)皮層 p-Akt蛋白的含量降低，與同時相的模型組相比較無明顯差異。電針組各組右側(cè)皮層PTEN蛋白的含量升高幅度不大。 (4)模型組各組大鼠大腦皮層中腦微血管內(nèi)皮細胞 cyclinD1、caspase9 陽性細胞率均高于正常對照組和

8、假手術(shù)組(P<0.005，P<0.01)，其中cyclinD1 于缺血再灌注4d達高峰，caspase9于缺血再灌注2d達高峰，且持續(xù)至缺血再灌注8d；電針組在缺血再灌注早期(即1d和2d)大腦皮層中腦微血管內(nèi)皮細胞 cyclinD1 陽性細胞率顯著高于模型組(P<0.01)，但在缺血再灌注 8d腦皮層中腦微血管內(nèi)皮細胞 cyclinD1 陽性細胞率減少，電針組內(nèi)皮細胞Caspase9陽性細胞率均低于模型組(P<0.01)。 結(jié)

9、論: VEGF、Akt、PTEN、cyclinD1、caspase9 參與了腦缺血再灌注損傷后缺血腦區(qū)的血管新生的發(fā)生過程。電針對腦缺血再灌注損傷后VEGF介導的腦微血管新生的信號轉(zhuǎn)導具有良性調(diào)節(jié)作用，這一作用可能通過以下途徑實現(xiàn)的：有效調(diào)控PI3K/Akt/PTEN信號轉(zhuǎn)導通路，即有效調(diào)控生存因子Akt的活性并調(diào)控PTEN對Akt的調(diào)節(jié)；同時增加其上游VEGF mRNA的表達；激活下游cyclinD1蛋白的表達，抑制凋亡基因 casp