慢病毒載體介導HIF-1α基因修飾骨髓間質干細胞促進腦缺血大鼠神經功能恢復的實驗研究.pdf

1、目的：利用定點突變技術對HIF-1α進行定點突變獲得常氧下穩(wěn)定表達的HIF-1α突變體，構建攜帶HIF-1α基因的重組慢病毒，為下一步感染靶細胞并在體內外獲得長期、穩(wěn)定的表達打下基礎；探討HIF-1α修飾骨髓間質干細胞移植對腦缺血大鼠神經功能恢復的影響及其可能的作用機制。 方法：以pCDNA3.1-HIF-1α—P402A作為模板對HIF-1α的564、803位點進行定點突變，獲得pCDNA3.1-HIF-1α—P402A—P5

2、64G—N803A質粒，經KpnⅠ和BamHⅠ酶切下目的基因HIF-1α—P402A—P564G—N803A片段，回收純化并克隆至pEGFP—N2獲得pHIF-1α—P402A—P564G—N803A—EGFP。將HIF-1-P402A—P564G—N803A—EGFP片段定向克隆至pENTR/D—TOPO中，構建成Gateway入門載體pENTR—HIF-1α—P402A—P564G—N803A—EGFP。應用Gateway LR重組

3、反應將Gateway入門載體中目的基因轉入Gateway終載體pLenti6/V5-DEST中，構建成突變型HIF-1α慢病毒載體pLenti6/V5-HIF-1α—P402A—P564G—N803A—EGFP。將慢病毒載體與慢病毒包裝系統(tǒng)共轉染293FT細胞，收獲并純化病毒液；利用第一部分成功收獲并純化的病毒液感染BMSCs，獲得穩(wěn)定轉染HIF-1α的BMSCs后，通過RT—PCR和western blot的方法檢測HIF-1α在常氧

4、下的表達情況，同時檢測HIF-1α下游靶基因EPO，VEGF和CXCR4在mRNA水平的表達。大鼠在成功制作大腦中動脈阻塞模型后隨機分為三組：BMSCs—mHIF-1α移植組，BMSCs—EGFP移植組和PBS對照組。在缺血后3h經股靜脈進行體內移植。在細胞移植后的1，7，14，28天進行神經功能檢查。TTC染色觀察缺血體積。通過TUNEL分析缺血側腦組織的細胞凋亡數目。使用pax6、DCX抗體免疫熒光雙標的方法檢測內源性神經干細胞并定

5、量分析pax6/DCX雙陽性細胞的數目以觀察內源性神經干細胞在各實驗組的增殖、存活情況。 結果：經過各個步驟的鑒定，成功構建了攜帶HIF-1α基因的重組慢病毒，病毒滴度為3.36×108 TU/ml；常氧狀態(tài)下，BMSCs—mHIF-1α與BMSCs—EGFP相比，HIF-1α在mRNA及蛋白水平上的表達均上調，其下游基因EPO，VEGF和CXCR4 mRNA水平上的表達也明顯增加。細胞移植后的14天和28天，BMSCs—mHI

6、F-1α移植組較BMSCs—EGFP移植組和PBS對照組神經功能恢復明顯改善。腦缺血后3天，BMSCs—mHIF-1α移植組腦梗死灶體積較BMSCs—EGFP移植組和PBS對照組明顯減少。在細胞移植后7天，兩細胞移植組的凋亡細胞數量在缺血側大腦半球皮質區(qū)沒有明顯差異；而在海馬區(qū)，BMSCs—mHIF-1α移植組凋亡細胞數量明顯少于與BMSCs—EGFP移植組(P<0.05)；在細胞移植后14天，BMSCs—mHIF-1α移植組凋亡細胞數

7、量在海馬區(qū)和皮質區(qū)均少于BMSCs—EGFP移植組(P<0.05)。細胞移植后7天，BMSCs—mHIF-1α移植組在海馬區(qū)域觀察到pax6/DCX細胞數量明顯多于BMSCs—EGFP移植組和PBS對照組(P<0.05)。 結論：①通過定點突變技術對HIF-1α基因進行定點突變，獲得常氧狀態(tài)下穩(wěn)定表達的突變型HIF-1α；HIF-1α表達上調誘導其下游靶基因的表達。②慢病毒介導HIF-1α基因修飾骨髓間質干細胞移植能顯著改善腦缺