電針百會(huì)、足三里穴對(duì)腦缺血再灌注大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路影響的研究.pdf

1、目的：
　　腦缺血再灌注損傷病理機(jī)制十分復(fù)雜，細(xì)胞凋亡是缺血性腦損傷重要原因之一。線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的三條主要途徑。近年來內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路在腦缺血再灌注損傷中的作用成為研究熱點(diǎn)。本研究采用線栓法制作火鼠大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血再灌注模型，探討電針百會(huì)、足三里穴對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，為臨床治療腦血管病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：

2、　　隨機(jī)數(shù)字表法將63只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和電針組，每組根據(jù)再灌注時(shí)間進(jìn)一步分為24h和72h亞組。利用線栓法建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注損傷模型，并分別在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)取材。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，不插入線栓，模型組制作腦缺血再灌注模型，假手術(shù)組和模型組大鼠每日接受同電針組一樣的抓取束縛刺激。電針組造模成功后取百會(huì)、左足三里穴電針干預(yù)20min/日。
　　在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)評(píng)估大鼠的神經(jīng)功能缺損程度;

3、以TTC法評(píng)估大鼠腦梗死體積;Tunel法檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡情況;免疫熒光染色觀察NeuN及GFAP表達(dá);免疫組織化學(xué)染色和免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)腦缺血大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、磷酸化的真核細(xì)胞翻譯起始復(fù)合物2α(p-eIF2α)、Caspase12、Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá);采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)腦缺血大鼠GRP78、CHOP、p-eIF2α、Caspase12

4、、Bcl-2/Bax mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.神經(jīng)功能缺損情況:三組大鼠在造模前行為學(xué)表現(xiàn)一致，Longa評(píng)分為0分，且均能在10s之內(nèi)將前肢的粘附物移除。再灌注24h和72h，模型組、電針組大鼠Longa評(píng)分和粘附移除時(shí)間顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，造模后大鼠的感覺和運(yùn)動(dòng)均有下降;電針組大鼠在24h和72h的Longa評(píng)分均顯著低于模型組（P＜0.05）;再灌注24h，電針組大鼠的粘附移除時(shí)間與模型組無

5、明顯差異，再灌注72h，電針組大鼠粘附移除時(shí)間明顯較模型組縮短（P＜0.05）。
　　2.腦梗死情況:再灌注72h，假手術(shù)組大鼠各個(gè)腦片均為紅色，未見腦梗死區(qū);模型組和電針組大鼠均存在不同程度白色梗死區(qū)，主要分布于視交叉前后的大腦中動(dòng)脈供血區(qū)，與動(dòng)脈栓塞的位置一致;電針組大鼠的腦梗死體積顯著低于模型組(P＜0.05)。
　　3.TUNEL染色顯示:再灌注72h，模型組和電針組大鼠細(xì)胞凋亡顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05);電針

6、組細(xì)胞凋亡顯著低于模型組(P＜0.05)。
　　4.免疫熒光染色顯示:再灌注72h，模型組和電針組大鼠的NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05);與模型組相比，電針組大鼠的NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P＜0.05);GFAP的結(jié)果與NeuN免疫熒光結(jié)果相反，再灌注72h，假手術(shù)組的GFAP陽性細(xì)胞體積小、突觸少，熒光強(qiáng)度較弱，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，模型組和電針組大鼠的GFAP陽性細(xì)胞體積大、突觸多，熒光強(qiáng)度強(qiáng)

7、，星形膠質(zhì)細(xì)胞處于活化狀態(tài);電針組大鼠的GFAP平均熒光強(qiáng)度顯著低于模型組(P＜0.05)。
　　5.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo):
　　(1)GRP78:①免疫組化:GRP78蛋白主要在胞漿表達(dá)，假手術(shù)組GRP78蛋白呈低表達(dá)，且顯著低于同一時(shí)間點(diǎn)的模型組和電針組(P＜0.05);電針組與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，GRP78蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。②Western blot:模型組GRP78蛋白表達(dá)顯著高

8、于同一時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組(P＜0.05)，電針組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)GRP78蛋白表達(dá)與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(P＞0.05)。③qPCR:模型組和電針組GRP78mRNA表達(dá)顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組;電針組GRP78mRNA表達(dá)均高于同一時(shí)間點(diǎn)的模型組（P＜0.05）。
　　(2)CHOP:①免疫組化:CHOP蛋白在胞漿和胞核均有表達(dá)，假手術(shù)組大鼠CHOP蛋白呈低表達(dá)，再灌注24h，模型組CHOP蛋白表達(dá)與電針組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;再灌注7

9、2h，電針組CHOP蛋白顯著低于模型組(P＜0.05)。②Western blot:再灌注24h和72h，模型組和電針組CHOP蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05);電針組與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，CHOP蛋白顯著降低（P＜0.05）。③qPCR:同一時(shí)間點(diǎn)的模型組和電針組CHOP mRNA的表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05);再灌注24h、72h，電針組CHOP mRNA的表達(dá)顯著低于模型組(P＜0.05)。
　　(3)p

10、-eIF2α:①免疫組化:假手術(shù)組p-eIF2α蛋白呈低表達(dá)，再灌注24h及72h，模型組和電針組p-eIF2α蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05);再灌注24h，模型組和電針組p-eIF2α蛋白表達(dá)無顯著性差異;再灌注72h，電針組p-eIF2α蛋白表達(dá)顯著低于模型組(P＜0.05)。②Western blot:模型組和電針組p-eIF2α蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組;電針組與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，p-eIF2α蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0

11、.05)。③qPCR:假手術(shù)組p-eIF2αmRNA呈低表達(dá)，與假手術(shù)組相比，模型組和電針組p-eIF2αmRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05);電針組p-eIF2αmRNA表達(dá)顯著低于與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組(P＜0.05)。
　　(4)Caspase12:①免疫組化:Caspase12胞漿胞核均有表達(dá)，但以胞漿表達(dá)為主，與假手術(shù)組相比，模型組和電針組Caspase12蛋白表達(dá)均顯著增高(P＜0.05);再灌注24h，電針組與模型組C

12、aspase12蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，再灌注72h，電針組Caspase12蛋白表達(dá)顯著低于模型組(P＜0.05)。②Western blot:假手術(shù)組Caspase12蛋白呈低表達(dá)，模型組和電針組Caspase12蛋白表達(dá)均顯著增高(P＜0.05);電針組與模型組相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Caspase12蛋白表達(dá)均顯著降低(P＜0.05)。③qPCR:Caspase12mRNA表達(dá)與Western blotting法結(jié)果趨勢(shì)一致;電針組與同一

13、時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，Caspase12mRNA表達(dá)顯著降低，差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　(5)Bcl-2/Bax:①免疫組化:模型組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05);與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，電針組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高;再灌注24h，模型組和電針組Bax蛋白表達(dá)無顯著性差異，再灌注72h，電針組Bax蛋白表達(dá)顯著低于模型組(P＜0.05)。②We

14、stern blot:模型組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05），且在72h表達(dá)低于24h;模型組Bax蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，且在72h表達(dá)高于24h。電針組與模型組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。③qPCR:Bcl-2及Bax mRNA表達(dá)趨勢(shì)同Western blot;電針組與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，Bcl-2mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Bax

15、 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.電針百會(huì)、足三里穴能改善腦缺血再灌注72h大鼠的神經(jīng)功能缺損和腦梗死體積，并能降低細(xì)胞凋亡比例，對(duì)缺血腦組織具有一定的保護(hù)作用。
　　2.電針百會(huì)、足三里穴可促進(jìn)腦缺血再灌注72h大鼠NeuN表達(dá)上調(diào)，GFAP表達(dá)下調(diào)，具有保護(hù)缺血半暗帶神經(jīng)元，減輕神經(jīng)元丟失，抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞增生活化的作用。
　　3.大鼠腦缺血2h再灌注損傷24h及72h，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

16、相關(guān)分子GRP78、p-eIF2α、CHOP、Caspase12的蛋白及mRNA表達(dá)增加，缺血再灌注損傷誘發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，電針百會(huì)、足三里穴可通過UPR促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù);上調(diào)腦缺血大鼠抑制凋亡基因Bcl-2表達(dá)，下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中p-eIF2α、CHOP、Caspase12蛋白及mRNA的表達(dá)，減少凋亡基因Bax表達(dá)，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕腦缺血再灌注損傷。
　　4.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑在腦缺血再灌注損傷病理機(jī)制中有重要作用，本研

17、究發(fā)現(xiàn)電針可能通過干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕腦缺血再灌注損傷。
　　創(chuàng)新點(diǎn)：
　　以線栓法成功復(fù)制腦缺血再灌注損傷大鼠模型并采用電針百會(huì)、足三里穴干預(yù)，通過檢測(cè)大鼠的神經(jīng)功能情況和腦梗死體積，直觀的驗(yàn)證了電針的有效性;并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路作為切入點(diǎn)，采用免疫組化、蛋白印跡、qPCR法分別從蛋白及基因水平檢測(cè)腦組織中GRP78、CHOP、p-eIF2α、Caspase12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路上的重要指標(biāo)的表達(dá)，探討電針百會(huì)、足三里穴對(duì)腦缺血