電針百會、足三里穴對腦缺血再灌注損傷大鼠EPO介導(dǎo)的JAK2-STAT3信號的影響.pdf

1、目的：腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemic reperfusion injury，CIRI)的病理機制非常復(fù)雜。腦缺血再灌注損傷大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用與促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)介導(dǎo)的酪氨酸激酶2（Janus family tyrosine kinases-2，JAK2）/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducers and activators of transcnpt

2、ion-3，STAT3)細(xì)胞通路關(guān)系密切，是目前研究熱點之一。本研究采用線栓法制作大鼠大腦中動脈閉塞腦缺血再灌注模型，探討電針百會、足三里穴對大鼠EPO介導(dǎo)的JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、腦水腫和細(xì)胞凋亡的影響，為臨床治療缺血性腦血管病進一步提供實驗依據(jù)。
　　方法:SPF級成年雄性SD大鼠36只，采用隨機數(shù)字表法分為3組（每組12只）：假手術(shù)組（S組）、模型組（M組）和電針百會、足三里組（EA組）。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總、頸

3、內(nèi)和頸外動脈，不插入線栓;模型組制作采用線栓法大腦中動脈腦缺血再灌注損傷模型，假手術(shù)組和模型組大鼠不干預(yù)，僅接受同電針組一樣的抓取束縛刺激。電針組造模成功后取百會、左足三里穴電針干預(yù)，采用長城牌KWD-808Ⅱ電針儀，疏密波、頻率2-100Hz、強度約2mA，以肌肉收縮為度，時間為20min。電針組干預(yù)共2次。第一次干預(yù)在拔線栓后，第二次干預(yù)在處死前2h。模型組和電針組大鼠腦缺血2h再灌注，再灌注24h后麻醉處死。在腦缺血后2h及處死前

4、采用Ludmila Belayev12分評分法檢測各組大鼠運動、感覺完整性。處死前采用前肢踩空實驗檢測各組實驗大鼠前肢對感覺及運動的整合能力，采用網(wǎng)屏實驗評估各組大鼠前爪抓握能力及肌力情況。TTC染色檢測各組大鼠腦梗死體積，HE染色檢測缺血腦組織組織形態(tài)學(xué)的改變。免疫組化法檢測大鼠腦組織EPO/EpoR，JAK2/STAT3以及AQP9的表達情況。免疫熒光雙染法檢測大鼠腦組織中JAK2和神經(jīng)元，JAK2和星型膠質(zhì)細(xì)胞共表達的情況。Wes

5、tern Blot和qPCR方法檢測大鼠腦組織中EPO，EpoR，磷酸化的JAK2和STAT3，總的JAK2和STAT3以及水通道蛋白9(AQP9)mRNA和蛋白表達。原位末端標(biāo)記(terminaldeoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling，Tunel)染色法檢測腦組織中神經(jīng)元凋亡的情況。免疫熒光法觀察EPO+細(xì)胞和TUNEL+細(xì)胞共表達情況。

6、>　　結(jié)果:1.電針百會、足三里穴對缺血腦組織組織形態(tài)學(xué)的影響TTC染色示模型組大鼠腦組織缺血區(qū)域變白，與周圍正常鮮紅腦組織形成對比。假手術(shù)組大鼠腦組織無明顯白色，電針組大鼠腦缺血程度較模型組輕。顯示腦缺血區(qū)域集中在大腦中動脈供血區(qū)域（主要是皮質(zhì)區(qū)和紋狀體區(qū)）。HE染色示假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠腦組織缺血區(qū)域組織疏松，細(xì)胞間隙變大，神經(jīng)細(xì)胞腫脹，核仁模糊不清，甚至固縮或者消失。電針細(xì)大鼠腦組織缺血半暗帶區(qū)域組織疏松程度較模型組

7、程度輕，且固縮細(xì)胞核的細(xì)胞數(shù)量減少。2.電針百會、足三里穴對大鼠神經(jīng)行為學(xué)的改變Ludmila Belayev12分評分法提示假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)功能評分正常。模型組大鼠Ludmila Belayev12評分最為嚴(yán)重。缺血2h的評分?jǐn)?shù)值比缺血后24h的更高。2h模型組和電針組大鼠神經(jīng)功能評分差別無統(tǒng)計學(xué)意義;24h時間點電針組大鼠神經(jīng)功能評分明顯低于模型組（P＜0.05）。模型組和電針組大鼠的前肢踩空實驗評分較假手術(shù)組明顯升高，電針可以明

8、顯改善CIRI后大鼠的前肢踩空實驗評分(P＜0.05)。模型組和電針組大鼠的網(wǎng)屏實驗評分較假手術(shù)組明顯升高，電針可以明顯改善腦缺血再灌注損傷CIRI后大鼠的網(wǎng)屏實驗評分(P＜0.05)。3.電針百會、足三里穴對大鼠EPO-JAK2/STAT3信號通路表達的影響免疫組化、Western Blot以及qPCR結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組、電針組大鼠的EPO，EpoR mRNA和蛋白表達明顯升高，差異顯著(P＜0.05)，電針組與模型組比

9、較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組化，Western Blot以及qPCR結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組、電針組大鼠的JAK2/STAT3mRNA和蛋白表達明顯升高，差異顯著(P＜0.05)，電針組與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Western Blot提示：與假手術(shù)組相比，模型組、電針組大鼠腦組織中有活性的JAK2，STAT3(p-JAK2，p-STAT3)水平和總的JAK2，STAT3的比值p-JAK2/

10、JAK2，p-STAT3/STAT3明顯升高，差異顯著(P＜0.05)，電針組與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。4.JAK2在腦組織中的細(xì)胞定位免疫熒光雙染結(jié)果顯示：腦組織缺血半暗帶區(qū)域，JAK2陽性細(xì)胞趨于在NeuN陽性細(xì)胞中表達，而EPO陽性細(xì)胞和GFAP陽性細(xì)胞重合較少。提示JAK2主要在神經(jīng)元表達，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達較少。5.電針百會、足三里穴對大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響TUNEL染色提示：模型組大鼠腦組織中有大量

11、凋亡細(xì)胞表達。與模型組相比，電針百會、足三里穴可以明顯減少腦組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)目。模型組大鼠腦組織TUNEL染色和EPO免疫熒光雙染提示：腦組織中TUNEL陽性細(xì)胞和EPO陽性細(xì)胞趨于分離，提示腦缺血后對大鼠腦組織有保護作用的EPO表達增加，且對細(xì)胞凋亡具有抑制作用。6.電針百會、足三里穴對腦組織水腫相關(guān)蛋白AQP9的影響免疫組化、Western Blot以及qPCR結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組、電針組大鼠的AQP9mRNA和蛋白表

12、達明顯升高，差異顯著（P＜0.05），電針組與模型組比較，可以明顯降低腦組織中AQP9mRNA和蛋白表達水平（P＜0.05）。
　　結(jié)論:1.電針百會、足三里穴可對腦缺血大鼠產(chǎn)生以下影響：(1)其腦組織中腦梗死體積減少、細(xì)胞固縮和異常增生減輕。(2)有效改善大鼠Ludmila Belayev12分評分，前肢踩空實驗評分，網(wǎng)屏實驗評分。(3)可上調(diào)p-JAK2，p-STAT3蛋白，同時上調(diào)EPO，EpoR，JAK2，STAT3mRN

13、A和蛋白表達。激活EPO介導(dǎo)的JAK2/STAT3通路，減少細(xì)胞凋亡，保護缺血再灌注損傷腦組織，同時下調(diào)腦水腫相關(guān)蛋白AQP9mRNA和蛋白的表達。2.缺血再灌注損傷大鼠腦組織中JAK2發(fā)揮作用的細(xì)胞位點主要在神經(jīng)元，而不是星形膠質(zhì)細(xì)胞。[創(chuàng)新點]本研究發(fā)現(xiàn)，針刺大腦中動脈閉塞腦缺血再灌注模型大鼠百會、足三里穴可明顯減輕腦水腫、減少細(xì)胞凋亡，其機制與激活EPO介導(dǎo)的JAK2/STAT3通路、上調(diào)p-JAK2，p-STAT3，EPO，Ep