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文檔簡介
1、研究目的:
卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率在各類婦科腫瘤中位居首位,嚴(yán)重威脅了婦科腫瘤患者的生命。雖然多年來卵巢癌的診斷和治療手段已得到顯著提高,但是卵巢癌的患者5年生存率仍僅為30%。卵巢癌患者的死因多是由于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,然而對于卵巢癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病理機(jī)制我們尚未完全清楚。因此,研究卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制并探索一個有效的監(jiān)測指標(biāo)對于卵巢癌的診治是十分必要的。
缺氧是實體腫瘤微環(huán)境的基本特征之一,在促進(jìn)
2、腫瘤進(jìn)展、癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。大量體外實驗證明了缺氧能夠產(chǎn)生和誘導(dǎo)某些蛋白酶,從而降解細(xì)胞外基質(zhì);臨床研究也表明腫瘤缺氧與腫瘤轉(zhuǎn)移傾向有一定的關(guān)系。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α(Hypoxia-inducible factor-1α)是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧代謝的核心因子,在缺氧環(huán)境中表達(dá)上調(diào),參與了腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控。HIF-1α與多種腫瘤關(guān)系已經(jīng)得到證實,但對卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響尚未得到闡明。本研究將選擇卵巢癌A27
3、80細(xì)胞來檢測缺氧環(huán)境下HIF-1α對卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制。
研究方法:
1.采用乏氧培養(yǎng)箱模擬腫瘤低氧微環(huán)境,分別在常氧和缺氧的環(huán)境中培養(yǎng)卵巢癌A2780細(xì)胞;
2.通過實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡(western blot)檢測缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13) mRNA及蛋白的在常氧和缺氧環(huán)境中的表達(dá)情況;
3.應(yīng)用小干
4、擾RNA(small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染卵巢癌A2780細(xì)胞,通過顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,并通過RT-PCR驗證siRNA對A2780細(xì)胞HIF-1α基因抑制結(jié)果;
4.通過RT-PCR和western blot檢測siRNA干擾HIF-1α基因后MMP13 mRNA及蛋白的表達(dá)變化;
5.通過對穿過Transwell小室人工基底膜的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計,比較常氧環(huán)境下與缺氧環(huán)境下卵巢癌細(xì)胞
5、的侵襲轉(zhuǎn)移能力,以及siRNA干擾HIF-1α基因前后卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
實驗結(jié)果:
1.卵巢癌A2780細(xì)胞中HIF-1α mRNA在正常氧環(huán)境中可見表達(dá),HIF-1α的mRNA水平隨缺氧時間的延長,表達(dá)水平逐漸升高;正常氧環(huán)境中HIF-1α蛋白表達(dá)較少,經(jīng)缺氧培養(yǎng)后,A2780細(xì)胞中HIF-1α的蛋白含量明顯增多,在缺氧處理24h后其蛋白表達(dá)水平最高;
2.應(yīng)用FAM-siRNA轉(zhuǎn)染A2780細(xì)
6、胞,在顯微鏡下可觀察到分布廣泛的熒光,轉(zhuǎn)染效率可達(dá)85%以上,說明siRNA成功轉(zhuǎn)入A2780細(xì)胞并取得良好的轉(zhuǎn)染效果;
3.siRNA能夠有效地抑制HIF-1α基因的表達(dá),mRNA水平抑制率達(dá)到80%,蛋白水平抑制率達(dá)到60%以上;
4.與常氧培養(yǎng)環(huán)境相比,缺氧環(huán)境培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞中MMP13在mRNA水平和蛋白水平均顯著增多,經(jīng)相關(guān)性分析,MMP13表達(dá)與HIF-1α呈正相關(guān),Pearson相關(guān)系數(shù)為0.8813;
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