硒對同型半胱氨酸誘導的人臍靜脈內皮細胞線粒體自噬損傷的抑制作用.pdf

1、目的：
　　當前心血管疾病成為所有致死原因的首位，而心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與血管內皮功能障礙密切相關。通過研究血管內皮功能來揭示心血管疾病的發(fā)病機制已成為重要的研究方法。線粒體自噬是當前研究熱點，同型半胱氨酸（Hcy）已被證實是心血管疾病危險因子，同型半胱氨酸能否誘導內皮細胞線粒體自噬值得探索?，F在研究發(fā)現高同型半胱氨酸血癥（HHcy）患者常伴隨高銅（Cu）血癥，因此Hcy和Cu的聯(lián)合作用對內皮細胞的影響值得探索。然而目前很多實驗

2、室所用血管內皮細胞傳代過多、分化嚴重，對實驗結果的說服性造成影響。本實驗通過提取原代人臍靜脈內皮細胞，初步探索同型半胱氨酸聯(lián)合銅損傷血管內皮細胞線的機制，是否有粒體自噬參與，自噬是有利還是有害，而硒對可能發(fā)生的作用的干預作用。
　　方法：
　　①提取原代人臍靜脈內皮細胞。
　　從新生兒臍帶提取臍靜脈內皮細胞。
　?、诓捎肕TT法，檢測不同濃度的Hcy、Cu、Se、Hcy+Cu及Hcy+Cu+Se對細胞增殖的影響。

3、
　　以硫酸銅溶液及亞硒酸鈉溶液為銅離子及Se的來源，實驗分為：（1）單純Hcy對細胞增殖的影響，Hcy濃度分別為10μM、20μM、40μM、100μM、200μM；（2）單純銅及單純硒對細胞增殖的影響，Cu濃度分別為10μM、20μM、30μM、40μM、50μMμM；Se濃度分別為0.4μM、1μM、2μM、5μM、10μM；（3）加銅是否加重Hcy抑制增殖作用，各組合濃度為Hcy40μM+Cu10μM、Hcy40μM+Cu

4、20μM、Hcy40μM+Cu30μM、Hcy40μM+Cu40μM、Hcy40μM+Cu50μM；Hcy及Cu的處理時間均為48小時。
　?、鄄捎肕TT法探索最適Se濃度。
　　通過方法②中我們發(fā)現Hcy從40μM開始對細胞增殖產生了明顯抑制，在該實驗Cu及Se的限定濃度范圍內，單純加銅或單純加硒對細胞增殖無明顯影響，而在Hcy濃度為40μM時，加不同濃度的Cu加重了對細胞增殖的抑制作用。本實驗選取Hcy40μM+Cu40

5、μM作為人臍靜脈內皮細胞損傷模型，通過加不同濃度硒來探討硒的作用。實驗分為正常對照組、Hcy40μM+Cu40μM+Se0.4μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se1μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se2μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se5μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se10μM組。處理方法同②中。
　?、芗毎魇郊夹g檢測Hcy+Cu、Hcy+Cu+Se處理組ROS含量，探討Se對ROS生成量的影響。<

6、br>　　采用DCFH-DA熒光探針、流式細胞儀技術檢測活性氧。分為正常對照組、Hcy40μM+Cu40μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se2μM組。
　?、菁毎魇郊夹g檢測Hcy+Cu、Hcy+Cu+Se處理組線粒體膜電位
　　采用JC-1染料利用細胞流式技術檢測線粒體膜電位，實驗分為正常對照組、Hcy40μM+Cu40μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se2μM組。
　?、藜毎魇郊夹g檢測Hcy+Cu、H

7、cy+Cu+Se處理組細胞凋亡率
　　采用AnnexinV法檢測細胞凋亡率，實驗分為正常對照組、Hcy40μM+Cu40μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se2μM組。
　?、叩鞍酌庖哂≯E法檢測LC3、PINK1蛋白表達量，探討Hcy+Cu加重人臍靜脈內皮細胞線粒體自噬的可能，以及Se的干預作用。
　　實驗分為正常對照組、Hcy40μM+Cu40μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se2μM組，Western-b

8、lot檢測LC3級PINK1蛋白表達，探討Hcu+Cu能否導致細胞自噬加重。
　　結果：
　?。?）成功提取原代人臍靜脈內皮細胞。
　?。?）40μM及以上的Hcy抑制細胞增殖，P<0.05，且隨Hcy濃度增加抑制作用提高，P<0.05。Hcy和Cu的聯(lián)合作用能加重細胞增殖的抑制作用。
　?。?）0.4μM到5μM的Se對Hcy+Cu所致細胞增殖抑制具有減輕作用，P<0.05；且硒的濃度為2μM時減輕抑制作用最明

9、顯，P<0.05。
　?。?）Hcy+Cu+Se組ROS含量較Hcy+Cu組低（P<0.05），但較ctrl組高(P<0.05)。
　?。?）Hcy+Cu+Se組膜電位較Hcy+Cu組高（P<0.05），但較ctrl組低(P<0.05)。
　?。?）Hcy+Cu+Se組凋亡率較Hcy+Cu組低（P<0.05），但較ctrl組高(P<0.05)。
　?。?）Hcy+Cu+Se組LC3II/LC3I灰度值較Hcy+C

10、u組低（P<0.05），但較ctrl組高(P<0.05)；Hcy+Cu+Se組PINK1灰度值較Hcy+Cu組低（P<0.05），但較ctrl組高(P<0.05)。
　　結論：
　?、偻桶腚装彼釓?0μM濃度開始能抑制人臍靜脈內皮增殖，同型半胱氨酸濃度越高，細胞增殖抑制越顯著；
　　②Cu加重了同型半胱氨酸抑制人臍靜脈內皮細胞增殖；
　?、畚軠p輕Cu和同型半胱氨酸對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響，且較適合人臍靜脈