14-3-3β基因?qū)SHV感染細(xì)胞遷移、凋亡及細(xì)胞周期作用的研究.pdf

1、目的：本研究旨在利用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方法研究14-3-3β基因?qū)CBL-1（KSHV positive and EBV negative human B cells）細(xì)胞遷移、凋亡以及細(xì)胞周期的影響，探討14-3-3β基因在卡波氏肉瘤（Kaposi's Sarcoma，KS）發(fā)生發(fā)展中的作用以及14-3-3β基因在KS發(fā)病中可能的機(jī)制。 方法：通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將14-3-3β真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入BCBL-1細(xì)胞，利用G4

2、18篩選試劑篩選細(xì)胞4～5周，從而獲得14-3-3β真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BCBL-1細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后通過(guò)Western-blot鑒定含外源性基因14-3-3β的細(xì)胞，證實(shí)基因轉(zhuǎn)染是否成功，并觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)；篩選4周后再通過(guò)Western-Blot鑒定外源性基因14-3-3β的表達(dá)，證實(shí)外源基因是否依然存在。利用Transwell細(xì)胞遷移分析方法分析14-3-3β基因?qū)CBL-1細(xì)胞遷移的影響；利用碘化丙啶（PI）染色試劑盒

3、，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析轉(zhuǎn)染14-3-3β基因后細(xì)胞周期時(shí)相比，利用生物學(xué)規(guī)律公式計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)（proliferation index，PI）；利用Annexin V-FITC Apoptosis Deteaion kit試劑盒，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析轉(zhuǎn)染14-3-3β基因后細(xì)胞的凋亡率（apoptosis rate，AR）。 結(jié)果：（1）轉(zhuǎn)染72小時(shí)與篩選4周后，通過(guò)Western-Blot均檢測(cè)到外源性基因14-3-3β

4、的表達(dá)。（2）Transwell細(xì)胞遷移分析方法分析細(xì)胞遷移，分析結(jié)果顯示：遷移6小時(shí)時(shí)重組體轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移數(shù)分別為35.75±8.07、20.13±5.25、19.38±5.26，遷移8小時(shí)時(shí)重組體轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移數(shù)分別為52.63±10.62、32.25±5.80、32.38±6.35，6小時(shí)與8小時(shí)時(shí)重組體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移數(shù)與空載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組比較，均有顯著性差異（P<0.05）。（

5、3）細(xì)胞周期檢測(cè)分析結(jié)果顯示重組體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的S％=2.03±0.39、G2％=1.12±0.33，與空載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組比較，均有顯著性差異（p<0.05）。重組體轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組增殖指數(shù)分別為3.16±0.59％、1.10±0.39％、1.09±0.36％，重組體轉(zhuǎn)染組與空載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組比較，均有顯著性差異（p<0.05）。（4）細(xì)胞凋亡率檢測(cè)分析結(jié)果顯示重組體轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組及朱轉(zhuǎn)染組BCBL-1細(xì)胞的凋