七鰓鰻過(guò)氧化物還原酶2(Peroxiredoxin2)基因克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、過(guò)氧化物還原酶(Peroxiredoxin,Prx)是在生物體中廣泛表達(dá)的一類(lèi)新的抗氧化蛋白家族,在進(jìn)化上高度保守,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、增殖、分化、凋亡及免疫細(xì)胞毒等進(jìn)程,對(duì)于生物體維持正常生命活動(dòng)起關(guān)鍵作用。七鰓鰻作為脊椎動(dòng)物最直接的祖先,在進(jìn)化上因連接著脊椎與無(wú)脊椎動(dòng)物而具有極高的研究?jī)r(jià)值,為深入探索脊椎動(dòng)物的起源與進(jìn)化提供了豐富的遺傳信息。目前關(guān)于Prx的研究多集中在硬骨魚(yú)及哺乳動(dòng)物,七鰓鰻中是否存在Prx尚不明確。本論文利用

2、分子生物學(xué)手段和生物信息學(xué)方法,從現(xiàn)存最古老的無(wú)頜類(lèi)脊椎動(dòng)物七鰓鰻(Lampetra japonica)口腔腺cDNA文庫(kù)中搜索到一條Prx2同系物,對(duì)其基因進(jìn)行克隆、進(jìn)化和表達(dá)分析,可以揭示七鰓鰻Prx2基因與無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物Prx2基因間的進(jìn)化關(guān)系,有助于從分子水平上闡述脊椎動(dòng)物Prx家族的起源和進(jìn)化；此外,七鰓鰻口腔腺因分泌抗凝血?jiǎng)?、抗腫瘤劑以及麻醉劑而得到廣泛關(guān)注,而七鰓鰻口腔腺分泌Prx2過(guò)氧化物酶活性的確定,使其有望成為

3、潛在的抗氧化制劑,同時(shí)為進(jìn)一步闡釋七鰓鰻特有的寄生生活習(xí)性提供了理論依據(jù)。
　　 本研究通過(guò)對(duì)日本七鰓鰻口腔腺cDNA文庫(kù)1300多條有效EST序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)一條能夠翻譯Prx2模體的開(kāi)放閱讀框,長(zhǎng)594 bp,編碼197個(gè)氨基酸,理論分子量21.7 kDa。具有典型的2-Cys Prx的兩個(gè)氧化還原活性的半胱氨酸殘基,且活性半胱氨酸殘基周?chē)Ｊ啬ｓw分別為FFYPLDFTFVCPTEI和GEVCPA。七鰓鰻Prx2

4、不含有信號(hào)肽和跨膜區(qū)。在氨基酸水平上,與脊椎動(dòng)物Prx1和Prx2均具有70％以上的序列相似性。為了進(jìn)一步說(shuō)明七鰓鰻Prx2與Prx1和Prx2亞族的關(guān)系,構(gòu)建基于鄰接法的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),發(fā)現(xiàn)七鰓鰻Prx2與脊椎動(dòng)物Prx2亞族構(gòu)成一簇,而與Prx1亞族親緣關(guān)系較遠(yuǎn),說(shuō)明克隆到的七鰓鰻Prx同系物屬于Prx2亞族；此外,對(duì)七鰓鰻Prx2進(jìn)化地位進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)七鰓鰻Prx2進(jìn)化地位比較原始,與硬骨魚(yú)Prx2親緣關(guān)系較近,符合生物由低等到高等的

5、客觀自然進(jìn)化規(guī)律。
　　 利用基因工程手段,設(shè)計(jì)特異性引物,以GAPDH作為內(nèi)參基因,Real-time PCR法檢測(cè)Prx2 mRNA在七鰓鰻口腔腺、心臟、肝臟、腎臟、鰓、腸、紅細(xì)胞和白細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)Prx2在七鰓鰻上述組織中廣泛表達(dá),且在紅細(xì)胞中高豐度表達(dá),進(jìn)一步經(jīng)脂多糖(LPS)刺激后,Prx2在紅細(xì)胞中的表達(dá)量明顯上調(diào),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說(shuō)明Prx2與七鰓鰻紅細(xì)胞抗氧化防御密切相關(guān),對(duì)保護(hù)紅細(xì)胞免受活性氧

6、自由基的氧化損傷起重要作用；此外,Prx2在清除病原菌的防御反應(yīng)中也發(fā)揮至關(guān)重要的作用。
　　 進(jìn)一步構(gòu)建pET23b-Prx2原核表達(dá)載體,并在E.coli BL21中進(jìn)行表達(dá),組氨酸親和層析柱純化,獲取七鰓鰻Prx2重組蛋白(recombinant L.japonica Prx2,rLj-Prx2)純品。以純化的重組蛋白為抗原免疫新西蘭兔,制備兔抗七鰓鰻血清Prx2蛋白多克隆抗體。對(duì)日本七鰓鰻口腔腺進(jìn)行免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)Pr

7、x2在七鰓鰻口腔腺的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)主要集中在上皮細(xì)胞和致密結(jié)締組織細(xì)胞中。免疫印跡法進(jìn)一步檢測(cè),發(fā)現(xiàn)自行制備的多克隆抗體能夠與口腔腺天然分泌產(chǎn)物和重組蛋白均發(fā)生明顯的特異性結(jié)合,說(shuō)明Prx2蛋白不僅存在于口腔腺細(xì)胞中,同時(shí)也能被分泌到胞外,雖不含信號(hào)肽,卻是一種分泌蛋白。這對(duì)于維持其特殊的寄生生活方式起重要作用,能夠更好地抵抗來(lái)自宿主免疫防御系統(tǒng)和代謝過(guò)程中產(chǎn)生活性氧的攻擊,形成保護(hù)機(jī)體免受氧化劑損傷的天然屏障。
　　 對(duì)rLj-P

8、rx2進(jìn)行了體外過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)。研究表明,rLj-Prx2有還原H2O2的解毒能力,且還原能力與重組蛋白的濃度成正比。同時(shí)這種還原活性是硫醇類(lèi)物質(zhì)依賴的,當(dāng)反應(yīng)體系中存在二硫蘇糖醇(DTT)時(shí),DTT作為供氫體將被氧化的rLj-Prx2還原,使之重新具有抗氧化生物學(xué)活性。進(jìn)一步進(jìn)行了DNA缺刻分析,構(gòu)建DTT/Fe3+/O2混合功能氧化酶體系,發(fā)現(xiàn)在一些自由基如羥自由基對(duì)DNA造成損傷時(shí),rLj-Prx2對(duì)超螺旋DNA也具有一定程