七鰓鰻乙醛脫氫酶9和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4的基因克隆、原核表達(dá)及生物活性研究.pdf

1、七鰓鰻，現(xiàn)存最古老的無(wú)頜類(lèi)脊椎動(dòng)物之一，因其獨(dú)特的進(jìn)化地位和免疫系統(tǒng)獲得了關(guān)注，成為研究脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)起源及進(jìn)化的新型模式生物，因此七鰓鰻的先天免疫防御系統(tǒng)中必然存在一系列與解毒及參與水生動(dòng)物氧化抗菌反應(yīng)的相關(guān)蛋白。本論文首次從日本七鰓鰻（Lampetra japonica）白細(xì)胞中獲得了乙醛脫氫酶9(aldehyde dehydrogenase9，ALDH9)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione perox

2、idase4，GPx4)的同源基因，通過(guò)基因克隆、重組表達(dá)及生物信息學(xué)方法對(duì)基因進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，為更好的了解其活性奠定了基礎(chǔ)。
　　乙醛脫氫酶(ALDHs)，能夠?qū)⒉煌╊?lèi)氧化為相應(yīng)的酸類(lèi)，在內(nèi)源性和外源性醛解毒過(guò)程中扮演了重要的角色。目前為止ALDH在哺乳動(dòng)物及微生物中已有所研究，但其在魚(yú)類(lèi)及兩棲類(lèi)動(dòng)物中研究較少。本論文首次克隆并原核表達(dá)了來(lái)自于日本七鰓鰻的ALDH9(LjALDH9)基因。LjALDH9 ORF區(qū)共1566 bp

3、，編碼521個(gè)氨基酸，理論分子量為55.68 kDa。LjALDH9蛋白含有信號(hào)肽區(qū)域(1-29)、Cys315活性位點(diǎn)及Aldedh結(jié)構(gòu)域。除去信號(hào)肽區(qū)域其理論分子量為52.92 kDa，等電點(diǎn)為5.57。重組LjALDH9以包涵體形式存在，通過(guò)變性、復(fù)性及純化對(duì)酶活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示LjALDH9酶的最適反應(yīng)pH為7.0，最適溫度16-23℃，Mn2+為其激活劑。實(shí)時(shí)定量PCR表明LjALDH9在口腔腺中呈現(xiàn)高表達(dá)，證明了LjA

4、LDH9在七鰓鰻寄生生活階段發(fā)揮著重要作用。
　　谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)，是一類(lèi)抗氧化酶，能夠減少脂質(zhì)氫過(guò)氧化物、氫過(guò)氧化物和有機(jī)氫過(guò)氧化物，維持組織正常的氧化還原水平，避免DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等的氧化損傷。本論文首次克隆得到日本七鰓鰻GPx4基因(LjGPx4)及其基因組DNA序列。LjGPx4 ORF區(qū)全長(zhǎng)477 bp，編碼158個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量預(yù)測(cè)為18.06 kDa，理論等電點(diǎn)為7.75。酶的活性位點(diǎn)為硒代半