褶紋冠蚌1-Cys和2-Cys型過(guò)氧化物還原酶基因的分子克隆及表達(dá).pdf

1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得直昌太堂或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。與我二垌工作的同志對(duì)本研究所做的任何一0，貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名(手寫)：彩艄毛南峰字日期：≯卅，，年多月frj’日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書

2、本學(xué)位論文作者完全了解直昌太堂有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)直昌太堂可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編本學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)中國(guó)科學(xué)技術(shù)信息研究所和中國(guó)學(xué)術(shù)期刊(光盤版)電子雜志社將本學(xué)位論文收錄到《中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》和《中國(guó)優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》中全文發(fā)表，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)向社會(huì)公眾

3、提供信息服務(wù)。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名(手寫)：餮嗚袒導(dǎo)師簽名(手寫)：匆銥簽字日期多_，，年∥月u一日簽字日期：抄f／，年∥月肛啊墊堊㈣炒嬲___________。_____________________‘‘。__I‘。?！瘛！?。。。?！痮‘。。。。?！?。?！??！！??！??！畂‘’‘‘。?！?。。?！?。o。‘。H■■一一一摘要褶紋冠蚌(Cristariaplicata)是我國(guó)主要的淡水育珠

4、蚌之一，隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展和環(huán)境惡化，由病原體，化學(xué)物質(zhì)引起的各種疾病頻繁發(fā)生于褶紋冠蚌的養(yǎng)殖群體中。過(guò)氧化物還原酶(Peroxiredoxin)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的抗氧化酶家族，能夠維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡通過(guò)消除細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化氫和烷基過(guò)氧化氫。本對(duì)褶紋冠蚌的1CysPrx和2Cys型Prx基因進(jìn)行研究，以期闡明這兩類抗氧化蛋白在褶紋冠蚌免疫統(tǒng)中的作用機(jī)制，為蚌類抗病機(jī)理研究提供理論依據(jù)。1褶紋冠蚌!Cys過(guò)氧化物還原酶的克隆及表達(dá)研究一

5、，‘褶紋冠蚌Prx6(CpPrx6)基因的cDNA序列全長(zhǎng)1617bp；其中5’端不翻譯區(qū)為71bp，3’端不翻譯區(qū)為889bp，開放閱讀框?yàn)?57bp，可以編碼218個(gè)氨基酸。CpPrx6的預(yù)測(cè)分子量為2424kDa，理論等電點(diǎn)為633。同源性分析顯示CpPrx6含有1CysPrx共有的保守GPX催化中心“PVCTTE“和脂肪酶基序“GKSW”。CpPrx6二級(jí)結(jié)構(gòu)包含6個(gè)q螺旋、12個(gè)p折疊。經(jīng)序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明褶紋冠蚌與

6、南極帽貝(Hyriopsiscumingii)、太平洋牡蠣(Crassostreagigas)、皺紋盤鮑(Haliotisdiscusdiscus)的1Cys過(guò)氧化物還原酶基因具有非常高的同源性。RTPCR檢測(cè)顯示，CpPrx6基因在血細(xì)胞、外套膜、閉殼肌、肝臟、鰓等組織中均有表達(dá)，其中以鰓組織表達(dá)最強(qiáng)，顯著高于其他組織。嗜水氣單胞茵刺激后在肝臟中12h內(nèi)CpPrx6基因的表達(dá)量不斷上升，24h時(shí)恢復(fù)到正常水平。在刺激后6h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和

7、對(duì)照組之間具有顯著性差異。12h時(shí)達(dá)到極顯著。將CpPrx6進(jìn)行體外重組并在大腸桿菌EcoliBL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。利用SDSPAGE分析表達(dá)產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組較空白對(duì)照菌在40KDa處增加了一條明顯的蛋白條帶。說(shuō)明CpPrx6基因在PET原核表達(dá)系統(tǒng)能夠得到表達(dá)。2褶紋冠蚌2Cys過(guò)氧化物還原酶的克隆及表達(dá)研究褶紋冠蚌TP)【基因的eDNA序列全長(zhǎng)1247bp：其中5’端UTR為90bp，3’端UTR為566bp

8、，開放閱讀框(OpenReadingFrame，ORF)591bp，可以編碼196個(gè)氨基酸。CpTPx含有2CysPrx都含有含有保守Fmotif“FTFVCPTEI“和高度保守的輸水區(qū)域“VCPAGW“，并且也含有真核生物典型2CysPrx的特征序列“GGLG’’，由此可以得出結(jié)論：CpTPx屬于典型2CysPrx。CpTPx二級(jí)結(jié)構(gòu)包含5個(gè)a螺旋、7個(gè)p折疊，間隔有2段無(wú)規(guī)則卷曲。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，褶紋冠蚌TPx與其他物種的Prxl聚