山羊副流感病毒3型分離、鑒定及其核衣殼蛋白的原核表達.pdf

1、副流感病毒3型（Parainfluenza virus type3，PIV3）是引起人和動物呼吸道疾病的重要病原。主要有牛PIV3(BPIV3)和人PIV3(HPIV3)，BPIV3可引起牛嚴重的呼吸道疾病，并有較高的發(fā)病率和致死率，對養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的損失。但PIV3在羊群中的感染情況在國內外都鮮有研究和報道。2013年下半年起江蘇、安徽多地山羊養(yǎng)殖場育肥山羊陸續(xù)出現(xiàn)以呼吸道癥狀為主的疾病，臨床表現(xiàn)較以往嚴重，傳統(tǒng)藥物治療的治愈率低，向

2、我們提示了病原的特殊性。本研究將采集自表現(xiàn)為嚴重呼吸道癥狀的山羊臨床病料處理后接種MDBK細胞，連續(xù)傳代分離到病毒，進一步通過病毒蝕斑純化實驗純化病毒，經(jīng)RT-PCR和血凝性鑒定證明病毒分離成功。通過對其基因測序及病原學特性研究證實其不同于其他PIV3，是PIV3新成員，將該毒株命名為山羊副流感病毒3型（Caprine parainfluenza virus3，CPIV3）JS2013株。
　　為了進一步探究新分離得到的CPIV3

3、 JS2013株的致病性，本試驗采用PIV3易感動物豚鼠研究此病毒在動物體內的復制及機體組織病理損傷等情況。攻毒后2天攻毒組的豚鼠開始出現(xiàn)打噴嚏、流鼻涕、眼分泌物增多及腹式呼吸的臨床癥狀，實驗過程中出現(xiàn)較高的致死率。攻毒后3天可以檢出病毒血癥，持續(xù)到攻毒后第7天，攻毒后第3天開始直到第14天均可以從肺組織中檢測到病毒。剖檢觀察攻毒組豚鼠，豚鼠肺出現(xiàn)實變、淤血、腫大，病理組織學檢測發(fā)現(xiàn)攻毒組豚鼠肺組織出現(xiàn)肺泡間隔增寬、肺泡融合、炎性細胞浸

4、潤等變化。HI試驗表明豚鼠感染后第5天開始出現(xiàn)血凝抑制抗體，之后持續(xù)升高至21天仍保持較高的水平。以上結果表明CPIV3 JS2013株對豚鼠具有較強的致病性，且豚鼠是一種研究CPIV3較為理想的實驗動物。
　　以本試驗分離的CPIV3 JS2013株純化的第4代病毒液為樣本，提取總RNA，根據(jù)GenBank上已發(fā)表的各PIV3成員的全基因組序列，設計1對特異性引物擴增CPIV3JS2013株N基因的部分片段。將其克隆到pMD18

5、-T載體上，篩選并鑒定出陽性重組質粒pMD18-T-N，再將其克隆到原核表達載體質粒pET-32a(+)上，經(jīng)菌液PCR、雙酶切、測序鑒定出陽性重組質粒pET-32a-N，將其轉化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導后，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，表明CPIV3 JS2013株N基因獲得高效表達。Western-blot檢測表明本試驗表達的重組N蛋白具有良好的反應原性。將該蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體，IFA檢測顯示良好的