亮氨酸拉鏈對(duì)人副流感病毒3型HN蛋白功能的影響.pdf

1、副粘病毒是一類對(duì)人和動(dòng)物致病的重要病毒，在世界范圍內(nèi)流行，分為兩個(gè)亞科：副粘病毒亞科和肺病毒亞科。副粘病毒亞科包括副粘病毒屬、麻疹病毒屬和腮腺炎病毒屬；副粘病毒屬主要包括人副流感病毒（hPIV）、新城疫病毒（NDV）和仙臺(tái)病毒（SV），麻疹病毒屬主要包括麻疹病毒（MV），腮腺炎病毒屬主要有流行性腮腺炎病毒（MuV）。肺病毒亞科只包括肺病毒屬，主要有人和牛呼吸道合胞病毒（RSV）。 副粘病毒能夠引起人類呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病，如上

2、呼吸道感染、支氣管炎、毛細(xì)支氣管炎、肺炎、結(jié)膜炎、睪丸炎、卵巢炎等等，嚴(yán)重時(shí)甚至引起死亡。其中，MV、MuV、RSV等能引起兒童常見病，如麻疹、流行性腮腺炎以及呼吸道感染等。人副流感病毒3型（hPIV3）是嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎和肺炎的第二大病因，還可引起嬰幼兒的哮吼和喉炎。目前尚無有效的抗hPIV3治療措施。除感染人類外，副粘病毒還能感染動(dòng)物如禽類、馬類、豬類等。NDV是重要的禽類傳染病病原體，往往引起災(zāi)難性的、廣泛流行的疾病。此外，ND

3、V尚有一定的臨床意義，如誘導(dǎo)干擾素（IFN）、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤治療等。 本研究在原有工作的基礎(chǔ)上，利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建hPIV3 HN蛋白促細(xì)胞融合區(qū)域兩端亮氨酸拉鏈中的保守氨基酸突變體，然后檢測(cè)突變體與同源F蛋白共表達(dá)后的促細(xì)胞融合活性以及受體結(jié)合活性、細(xì)胞表面表達(dá)效率，從而確定亮氨酸拉鏈對(duì)hPIV3 HN蛋白功能的影響。 一、TM區(qū)亮氨酸拉鏈突變體對(duì)促細(xì)胞融合活性的影響 hPIV3 HN蛋白TM區(qū)亮氨酸拉鏈由

4、氨基酸L36～150組成，其中L36、L43和I50等氨基酸在副粘病毒中高度保守，采用同源重組PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)突變構(gòu)建突變體。每個(gè)突變體需要設(shè)計(jì)兩對(duì)含同源序列的引物，進(jìn)行兩次PCR。獲得的兩個(gè)PCR產(chǎn)物含有短同源末端序列，將其同時(shí)轉(zhuǎn)染大腸桿菌TG1后，二者會(huì)自動(dòng)重組形成完整的含突變位點(diǎn)的質(zhì)粒。為避免引入額外突變，引物中未引入酶切位點(diǎn)。轉(zhuǎn)染后提取質(zhì)粒，電泳結(jié)果正確，經(jīng)測(cè)序證實(shí)引入突變，成功將各保守氨基酸突變?yōu)楸彼幔ˋ）。由此得到3個(gè)單

5、獨(dú)突變體，分別命名為：L36A、L43A和I50A。在單獨(dú)突變的基礎(chǔ)上，構(gòu)建1個(gè)聯(lián)合突變體，命名為L(zhǎng)36A-L43A。將突變體分別轉(zhuǎn)染痘苗病毒vTF7-3預(yù)感染的BHK21細(xì)胞，采用定性（Giemsa染色）和定量（指示基因法）兩種方法檢測(cè)細(xì)胞融合情況。細(xì)胞融合功能經(jīng)校正后，消除了蛋白表達(dá)效率的影響。結(jié)果顯示，與野生型（vvt）hPIV3 HN基因相比，各單獨(dú)突變體促細(xì)胞融合活性有不同程度的降低。以wtHN基因促細(xì)胞融合活性為100％，突

6、變體L36A融合活性為wtHN基因的66．66％，突變體L43A融合活性為、vt HN基因的60．60％，突變體150A融合活性為、wt HN基因的57．60％。聯(lián)合突變體L36A-L43A轉(zhuǎn)染后未見細(xì)胞融合形成。 hPIV3 HN蛋白頸部近膜區(qū)的亮氨酸拉鏈由氨基酸L114～I(xiàn)128組成，其中L114、L121和I128在副粘病毒中高度保守。采用同源重組PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)突變。突變后提取質(zhì)粒后電泳結(jié)果正確，經(jīng)測(cè)序證實(shí)成功引入突

7、變。由此得到3個(gè)單獨(dú)突變體，分別命名為：L114A、L121A和I128A。在單獨(dú)突變的基礎(chǔ)上，構(gòu)建1個(gè)聯(lián)合突變體，命名為L(zhǎng)121A-I128A。將突變體分別轉(zhuǎn)染痘苗病毒vTF7-3預(yù)感染的BHK21細(xì)胞，采用定性（Giemsa染色）和定量（指示基因法）兩種方法檢測(cè)細(xì)胞融合情況。受體結(jié)合活性經(jīng)校正后，消除了蛋白表達(dá)效率的影響。以wt hPIV3 HN基因促細(xì)胞融合活性為100％，L114A促細(xì)胞融合活性為wtHN基因的53．00％，L1

8、21A促細(xì)胞融合活性為wtHN基因的59．10％，I128A促細(xì)胞融合活性為wtHN基因的90．90％。聯(lián)合突變體L121A-I128A轉(zhuǎn)染后未觀察到細(xì)胞融合。 頸部亮氨酸拉鏈附近及內(nèi)部的氨基酸P111、I112和I125在副粘病毒中亦是保守位點(diǎn)。同樣以同源重組PCR方法獲得3個(gè)單獨(dú)突變體，分別命名為：P111A、I112A和I125A。將突變體分別轉(zhuǎn)染痘苗病毒vTF7-3預(yù)感染的BHK21細(xì)胞，采用定性（Giemsa染色）和定

9、量（指示基因法）兩種方法檢測(cè)細(xì)胞融合情況。促細(xì)胞融合活性經(jīng)校正后，消除了蛋白表達(dá)效率的影響。以wt hPIV3 HN基因促細(xì)胞融合活性為100％，P111A為wt HN的43．90％，1112A為wt HN的39．40％，1125A為wt HN的34．80％。 各突變體分別進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析；秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)值H=28．78，P<0．05，表明各突變體促細(xì)胞融合活性差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中突變體I125

10、A活性最低，突變體I128A活性最高。 FACS分析表明，各突變體都成功在細(xì)胞表面表達(dá)，但與wt HN基因相比，表達(dá)效率有所降低。 二、亮氨酸拉鏈突變體對(duì)受體結(jié)合活性的影響 將上述獲得的11個(gè)突變體L36A、L43A、I50A、L114A、L121A、I128A、P111A、I112A、I125A、L36A-L43A和L121A-I128A分別轉(zhuǎn)染痘苗病毒vTF7-3預(yù)感染的BHK21細(xì)胞，采用血吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突

11、變體的受體結(jié)合活性。受體結(jié)合活性經(jīng)校正后，消除了蛋白表達(dá)效率的影響。結(jié)果表明各突變體對(duì)受體結(jié)合活性影響較小。與wt hPIV3 HN基因相比，TM區(qū)亮氨酸拉鏈的3個(gè)突變體中，突變體L36A受體結(jié)合活性和wt HN基因一樣，為100％，而突變體L43A和150A受體結(jié)合活性稍低，分別為wt HN基因的98．99％和91．92％。頸部近膜區(qū)亮氨酸拉鏈的3個(gè)突變體L114A、L121A和I128A受體結(jié)合活性分別為wt hPIV3 HN的95

12、．96％、92．93％和100％。此外，突變體P111A為wt HN的97．98％， I112A為wt HN的95．96％，I125A為wt HN的85．86％。兩個(gè)聯(lián)合突變體受體結(jié)合活性也與wt HN基因接近，L36A-L43A受體結(jié)合活性為wt HN基因的95．96％，L1121A-I128A為wt HN基因的93．94％。 各突變體分別進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)值H=17．99，P>0

13、．05，表明各突變體受體結(jié)合活性差別不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 三、F蛋白對(duì)HN蛋白受體結(jié)合活性的影響 將上述11個(gè)突變體分別與F蛋白共轉(zhuǎn)染痘苗病毒vTF7-3預(yù)感染的BHK21細(xì)胞，采用血吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突變體的受體結(jié)合活性。以wt HN基因受體結(jié)合活性為100％，突變體L36A受體結(jié)合活性最高，為wt HN基因的99．14％，突變體I125A受體結(jié)合活性最低，為wt HN的84．48％。采用秩和檢驗(yàn)分析HN單獨(dú)表達(dá)（血吸附HN組

14、）與HN和F蛋白共表達(dá)（血吸附HN+F組）兩組受體結(jié)合活性的差別，結(jié)果H=108．00，P<0．05，表明兩組存在差別，血吸附HN組受體結(jié)合活性比血吸附HN+F組高。 從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了hPIV3 HN蛋白TM區(qū)和頸部近膜區(qū)兩個(gè)亮氨酸拉鏈中保守氨基酸的突變體，共獲得突變體11個(gè)，其中9個(gè)單獨(dú)突變體，分別為L(zhǎng)36A、L43A、150A、L114A、L121A、I128A、P111A、I112A和I1

15、25A；在單獨(dú)突變的基礎(chǔ)上構(gòu)建了兩個(gè)聯(lián)合突變體，L36A-L43A和L121A-I128A。 TM區(qū)和頸部近膜區(qū)兩個(gè)亮氨酸拉鏈對(duì)于hPIV3 HN蛋白促細(xì)胞融合活性具有重要的作用。其中的保守氨基酸突變后，促細(xì)胞融合活性均有不同程度的降低，最低的為突變體I125A，僅為wt HN的34．80％，而突變體I128A融合活性最高，為wt HN的90．90％。其它突變體融合活性在39．40％～66．66％之間。而兩個(gè)聯(lián)合突變體轉(zhuǎn)染后未

16、見細(xì)胞融合形成。這進(jìn)一步證明hPIV3 HN蛋白促細(xì)胞融合區(qū)域不是位于頭部，而是位于TM區(qū)和頸部近膜區(qū)，并在氨基酸I125結(jié)尾，I125是對(duì)促細(xì)胞融合活性有著關(guān)鍵作用的氨基酸殘基；亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的完整性是副粘病毒細(xì)胞融合所必需的，對(duì)HN蛋白促細(xì)胞融合作用有著重要的影響。 HN蛋白促細(xì)胞融合區(qū)域兩端亮氨酸拉鏈對(duì)受體結(jié)合活性并無影響。各突變體受體結(jié)合活性與wt HN非常接近；突變體I125A受體結(jié)合活性為wt HN的85．86％，