副粘病毒HN糖蛋白功能性關(guān)鍵氨基酸定位與促細(xì)胞融合機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:
　　 新城疫病毒HN糖蛋白HR區(qū)域α位氨基酸和N481糖基化位點突變后降低細(xì)胞融合和HN-F蛋白相互作用的機(jī)制
　　 研究背景:
　　 新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)屬于副粘病毒科副粘病毒屬，為單股負(fù)鏈不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，能引起家禽發(fā)生新城疫(Newcastledisease，ND)。ND是一種主要累及呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)展迅速并且危害最為嚴(yán)重的家禽傳染病。人

2、類可因接觸病禽和活毒疫苗而引起結(jié)膜炎或淋巴腺炎。目前對ND缺乏有效的免疫防治措施，其研究障礙是對病毒與宿主細(xì)胞的相互作用過程尚不清楚，因此必須弄清NDV與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制。NDV是副粘病毒的典型代表，往往被作為副粘病毒的研究模型。
　　 細(xì)胞膜融合是NDV增殖與感染的關(guān)鍵步驟，也是感染細(xì)胞的典型病例特征。此過程主要由NDV包膜上的血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidaseprotein，

3、HN）和融合蛋白(fusionprotein，F(xiàn))協(xié)同完成，提示HN與F蛋白存在相互作用區(qū)域，并且與F蛋白的發(fā)生相互作用區(qū)域可能位于HN蛋白的莖部。目前NDV的HN與F蛋白的相互作用機(jī)制尚未完全明了。在NDV的HN蛋白莖部區(qū)域內(nèi)包含兩個七肽重復(fù)區(qū)域(hepadrepeatregions，HR)，分別是HR1(74～88aa)和HR2(96～110aa)，每一個HR形成的α-螺旋結(jié)構(gòu)可能參與HN與F蛋白的相互作用，L74、V81和V88是

4、HR1內(nèi)的α位點氨基酸，L96、I103和L110是HR2內(nèi)的α位點氨基酸。有研究表明HR區(qū)域內(nèi)α位點的氨基酸突變對HN蛋白的功能有重要影響，但是否會影響HN與F蛋白的相互作用未見報道。
　　 N-糖基化對NDVHN蛋白的折疊加工和功能都有重要影響。NDV的HN蛋白含有6個潛在的糖基化位點，只有4個潛在的糖基化位點即N119、N341、N433和N481存在N-糖基化，N-糖鏈的缺失影響NDV的毒力，但是否會影響HN與F蛋白的相

5、互作用尚未可知。
　　 研究目的:
　　 研究NDVHN蛋白的HR區(qū)域內(nèi)α位點氨基酸和N-糖基化位點氨基酸的功能，闡明NDV的HN蛋白促細(xì)胞融合及HN與F蛋白的相互作用機(jī)制，為有針對性地設(shè)計抗NDV感染的疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 1.NDV的HN蛋白突變體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染:利用融合PCR與體內(nèi)同源重組相結(jié)合的方法構(gòu)建α位氨基酸和N-糖基化位點突變體，經(jīng)測序后確定突變位點。應(yīng)用Lipofectami

6、neTM2000將空載體、HN的野生型、各突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或者和F蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染預(yù)感染的重組痘苗病毒vTF7-3的BHK-21細(xì)胞系。
　　 2.放射免疫沉淀以及放射免疫共沉淀:放射免疫沉淀是利用EXPRE35S35S復(fù)合物標(biāo)記總的HN和F蛋白，一半蛋白沉淀物不做處理，另一半蛋白沉淀物經(jīng)糖苷酶PNGaseF酶切;放射免疫共沉淀是分別利用EXPRE35S35S復(fù)合物和sulfo-NHS-SS-biotin標(biāo)記細(xì)胞表面的HN和F蛋白，

7、都采用還原條件下的10％SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，運用PerkinElmerCyclonePlus軟件分析。
　　 3.各突變株蛋白細(xì)胞表面表達(dá)效率及活性測定:流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面各突變株蛋白表達(dá)效率，Giemsa染色和指示基因法分別定性和定量測定其促細(xì)胞融合活性，血吸附法測定其受體結(jié)合活性，比色分析法測定其神經(jīng)氨酸酶活性。
　　 4.統(tǒng)計學(xué)方法:用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以(x)±s表示，應(yīng)用

8、t檢驗對突變株HN蛋白與野生型HN蛋白的測定結(jié)果進(jìn)行比較，P＜0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.NDV的HN蛋白HR區(qū)域內(nèi)6個α位氨基酸突變體構(gòu)建成功，分別是L74A、V81A、V88A、L96A、I103A和L110A，它們的促細(xì)胞融合活性都有不同程度的降低，分別占野毒株的22.6％、29.9％、24.7％、70.4％、9.1％和17.8％。與F蛋白的相互作用能力減弱，各突變株的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)

9、效率與野毒株相比差別均無統(tǒng)計學(xué)意義。除L96A的受體結(jié)合活性與野毒株大體一致外，其它突變株的受體結(jié)合活性都降低，I103A的受體結(jié)合活性降低最多，占野毒株的28.2％。L74A、V81A和L96A的神經(jīng)氨酸酶活性與野毒株大體一致，V88A也保持了野毒株HN蛋白78.5％的活性，I103A和L110A的神經(jīng)氨酸酶活性僅為野毒株的5.7％和5.2％。
　　 2.NDV的HN蛋白4個N-糖基化位點突變體構(gòu)建成功，分別為N119A、N3

10、41A、N433A和N481A,4個糖基化位點突變株的電泳速率較野毒株的電泳速率增快。經(jīng)糖苷酶PNGaseF酶切之后，各突變株與野毒株的電泳速率一致，N481A蛋白沉淀量較少。流式細(xì)胞術(shù)檢測N481A的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)率僅為野毒株的57.5％，而其他3個糖基化位點突變株的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)率與野毒株相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義。N119A、N341A和N433A仍然保持著和野毒株大體一致的促細(xì)胞融合活性，然而N481A的促細(xì)胞融合活性降低為野毒株

11、的66.2％。放射免疫共沉淀結(jié)果顯示N481A與F蛋白的相互作用能力降低為野毒株的53.6％，而其他3個糖基化位點突變株與F蛋白相互作用能力與野毒株相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義。N481A的受體結(jié)合活性和神經(jīng)氨酸酶活性都明顯降低，分別為野毒株的33.4％和6.5％，N119A和N341A突變株的受體結(jié)合活性和神經(jīng)氨酸酶活性與野毒株相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義，N433A的受體結(jié)合活性略有升高，而神經(jīng)氨酸酶活性降低為野毒株的70.0％。
　　 結(jié)

12、論:
　　 1.含有HR區(qū)域內(nèi)α位氨基酸突變的HN蛋白的促細(xì)胞融合活性的減少和HN蛋白的突變株與F蛋白的相互作用能力的降低有關(guān)，但兩者之間不成正比例。
　　 2.含有HR區(qū)域內(nèi)α位氨基酸突變的HN蛋白的受體結(jié)合活性、神經(jīng)氨酸酶活性和HN蛋白的突變株與F蛋白相互作用能力是一個平衡的網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控著HN蛋白的促細(xì)胞融合活性。
　　 3.NDV的HN蛋白HR區(qū)域α位氨基酸和N481位點突變后干擾細(xì)胞融合和HN與F蛋白相

13、互作用的機(jī)制不同。第481位的天冬酰胺突變?yōu)楸彼岷髮?dǎo)致HN蛋白折疊和加工異常，從而影響促細(xì)胞融合活性及HN與F蛋白的相互作用能力。而HR區(qū)域內(nèi)α位氨基酸突變后可能導(dǎo)致關(guān)于激活F蛋白的信號從HN蛋白頭部到莖部區(qū)域的傳導(dǎo)過程中出現(xiàn)變化，導(dǎo)致促細(xì)胞融合活性及HN與F蛋白的相互作用能力都降低。
　　 第二部分:
　　 人副流感病毒3型HN蛋白保守氨基酸突變分析
　　 研究背景:
　　 人副流感病毒(humanp

14、arainfluenzaviruses，hPIV)為副粘病毒科副粘病毒屬的主要成員之一，是一類引起嬰幼兒肺炎和下呼吸道疾病的重要病原體。hPIV分為1～4型，其中人副流感病毒3型（humanparainfluenzavirustype3，hPIV-3）不僅引起的疾病最嚴(yán)重，而且此型病毒檢出率也最高。但hPIV-3感染宿主細(xì)胞的機(jī)制卻并不清楚。
　　 hPIV-3感染宿主細(xì)胞周期包括吸附、穿入、脫殼、病毒基因組及蛋白質(zhì)的合成、子代

15、病毒顆粒的裝配及釋放等步驟。hPIV-3與宿主細(xì)胞膜的融合包括吸附、穿入和脫殼整個連續(xù)的過程。這一融合過程不僅是hPIV-3感染機(jī)體的第一道關(guān)口，也是病毒完成生命周期的關(guān)鍵步驟和抗病毒藥物的主要作用靶點。hPIV-3的表面鑲嵌著HN和F糖蛋白，HN糖蛋白必須通過識別并結(jié)合宿主細(xì)胞膜表面的唾液酸受體，激活F糖蛋白前體F0裂解為F1和F2，啟動膜融合過程。
　　 N-糖基化是hPIV-3的HN糖蛋白的一種重要的翻譯后修飾。宿主細(xì)胞膜

16、表面的內(nèi)源性凝集素受體和糖鏈結(jié)合蛋白都能與hPIV-3HN蛋白的N-糖鏈結(jié)合并幫助病毒順利介導(dǎo)膜融合過程，暗示N-糖鏈在hPIV-3誘導(dǎo)膜融合的過程中發(fā)揮重要作用。到目前為止，并沒有關(guān)于hPIV-3HN蛋白N-糖鏈功能的研究報道。
　　 hPIV-3的HN蛋白含有兩種受體結(jié)合/神經(jīng)氨酸酶活性位點，即Ⅰ型和Ⅱ型受體結(jié)合/神經(jīng)氨酸酶活性位點。R192、D216、E409、R424、R502、Y530和E549是位于Ⅰ型受體結(jié)合/神經(jīng)

17、氨酸酶活性位點內(nèi)的保守氨基酸，N551和H552為Ⅱ型受體結(jié)合/神經(jīng)氨酸酶活性位點內(nèi)的保守氨基酸。NDV的HN蛋白的Ⅰ型受體結(jié)合/神經(jīng)氨酸酶活性位點對神經(jīng)氨酸酶和促細(xì)胞融合活性具有重要作用，而Ⅱ型受體結(jié)合活性/神經(jīng)氨酸酶活性位點只對受體結(jié)合活性有重要作用，但Ⅱ型位點不是神經(jīng)氨酸酶活性位點。我們推測hPIV-3的HN蛋白Ⅰ型和Ⅱ型受體結(jié)合/神經(jīng)氨酸酶活性位點可能具有與NDV相似的功能。
　　 hPIV-3的HN蛋白氨基酸序列含有一

18、段六縮氨酸NRKSCS(252～257aa)，與第二個β折疊結(jié)構(gòu)相連，此區(qū)域是副粘病毒受體結(jié)合蛋白（HN、H和G蛋白）內(nèi)最長的一段保守氨基酸序列，從hPIV-3的HN蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)此區(qū)域距離受體結(jié)合/神經(jīng)氨酸酶活性位點很近，我們推測可能對HN蛋白的受體結(jié)合和神經(jīng)氨酸酶活性有著重要作用。
　　 對副粘病毒受體結(jié)合蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)hPIV-3的HN蛋白氨基酸序列除了含有最長的一段NRKSCS保守六縮氨酸外，還包含

19、保守三縮氨酸EGR(409～411)、GVV(476～478)和YTT(530～532)，分別位于HN蛋白的第四、第五和第六β折疊結(jié)構(gòu)內(nèi)。EGR和YTT三縮氨酸位于HN蛋白的受體結(jié)合口袋附近，其中E409和Y530也是Ⅰ型受體結(jié)合/神經(jīng)氨酸酶活性位點內(nèi)的保守氨基酸，β折疊結(jié)構(gòu)的三縮氨酸在副粘病毒科內(nèi)的受體結(jié)合蛋白中具有保守性，暗示三縮氨酸的結(jié)構(gòu)對HN蛋白的功能可能具有重要作用。
　　 研究目的:
　　 1.確定hPIV-

20、3的HN蛋白的N-糖基化位點及受體結(jié)合/神經(jīng)氨酸酶活性位點中保守氨基酸的功能和關(guān)鍵氨基酸;
　　 2.確定hPIV-3的HN蛋白的六縮氨酸和三縮氨酸的功能和關(guān)鍵氨基酸;
　　 3.闡明hPIV-3HN蛋白的促細(xì)胞融合及HN與F蛋白的相互作用機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1.hPIV-3HN蛋白突變體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染:利用融合PCR與體內(nèi)同源重組相結(jié)合的方法構(gòu)建單個和聯(lián)合突變體，經(jīng)測序最終確定突變位點。應(yīng)用L

21、ipofectamineTM2000將空載體、HN的野生型、各突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或者和F蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染預(yù)感染的重組痘苗病毒vTF7-3的BHK-21細(xì)胞系。
　　 2.放射免疫沉淀以及放射免疫共沉淀:放射免疫沉淀是利用EXPRE35S35S復(fù)合物標(biāo)記總的HN和F蛋白，一半蛋白沉淀物不做處理，另一半蛋白沉淀物經(jīng)糖苷酶PNGaseF酶切，放射免疫共沉淀是分別利用EXPRE35S35S復(fù)合物和sulfo-NHS-SS-biotin標(biāo)記細(xì)胞

22、表面的HN和F蛋白，都采用還原條件下的10％SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，運用PerkinElmerCyclonePlus軟件分析。
　　 3.各突變株蛋白細(xì)胞表面表達(dá)效率及活性測定:流式細(xì)胞儀分析各突變株的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)效率，Giemsa染色和指示基因法分別定性和定量測定其促細(xì)胞融合活性，血吸附法測定其受體結(jié)合活性，比色分析法測定其神經(jīng)氨酸酶活性，R18探針標(biāo)記法測定其半融合活性。
　　 4.細(xì)胞膜融合動態(tài)測定:應(yīng)用

23、R18探針標(biāo)記人紅細(xì)胞膜，加入已經(jīng)轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒的BHK-21細(xì)胞中，熒光光度計測定0～300S的熒光光度值，繪制動態(tài)曲線記錄細(xì)胞膜融合的動態(tài)變化。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)方法:用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以（x）±s表示，應(yīng)用t檢驗對突變株與野毒株的測定結(jié)果進(jìn)行比較，P＜0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.hPIV-3的HN蛋白糖基化位點突變體的構(gòu)建及功能測定
　　 4個

24、糖基化位點單個突變體G1、G2、G3和G4及四個聯(lián)合突變體G12、G14、G24和G124構(gòu)建成功。G1、G2、G4、G12、G14、G24和G124的電泳速率比野毒株稍快，G3的電泳速率與野毒株一致，各突變株蛋白經(jīng)PNGaseF酶切后，其電泳速率與野毒株都一致。hPIV-3的HN蛋白N-糖基化位點的缺失導(dǎo)致其促細(xì)胞融合活性的減少和受體結(jié)合活性降低（P＜0.05），但不影響細(xì)胞表面蛋白表達(dá)效率、神經(jīng)氨酸酶活性及HN與F蛋白的相互作用能力

25、，但聯(lián)合突變株不能完全激活共轉(zhuǎn)染的F蛋白的有效裂解。N-糖基化位點的缺失抑制了半融合活性和促進(jìn)F蛋白啟動細(xì)胞融合能力。
　　 2.hPIV-3的HN蛋白受體結(jié)合位點內(nèi)保守氨基酸突變體的構(gòu)建及功能測定
　　 hPIV-3的HN蛋白Ⅰ型受體結(jié)合/神經(jīng)氨酸酶活性位點中的7個保守氨基酸突變體R192A、D216A、E409A、R424A、R502A、Y530A和E549A，以及Ⅱ型受體結(jié)合/神經(jīng)氨酸酶活性位點中2個保守氨基酸突變

26、體N551A和H552A都構(gòu)建成功。除了N551A的促細(xì)胞融合活性略有升高（為野毒株的112.2％）外，其他突變株都有不同程度的降低。各突變株表面蛋白表達(dá)率都為野毒株的90％以上，并且差別均無統(tǒng)計學(xué)意義。HN蛋白的受體結(jié)合位點/神經(jīng)氨酸酶活性位點中保守氨基酸突變對HN與F蛋白的相互作用并沒有影響，但E409A、R424A、R502A和H552A促進(jìn)F蛋白裂解的能力分別降低為野毒株的54.8％、46.3％、56.3％和43.4％。除N55

27、1A受體結(jié)合活性與野毒株大體一致（為野毒株的100.1％）外，各突變株的受體結(jié)合活性均有不同程度降低(P＜0.05)。E549A和N551A的神經(jīng)氨酸酶活性與野毒株相比差別均無統(tǒng)計學(xué)意義，而其他突變株蛋白與野毒株相比有不同程度的降低（P＜0.05）。除N551A外其它突變株的半融合活性和促進(jìn)F蛋白啟動細(xì)胞膜融合能力有不同程度的降低。
　　 3.hPIV-3的HN蛋白六縮氨酸突變體的構(gòu)建及功能測定
　　 hPIV-3的HN

28、蛋白六縮氨酸突變體N252、R253、K254、S255、C256和S257構(gòu)建成功。各突變株細(xì)胞表面蛋白表達(dá)效率與野毒株相比差別均無統(tǒng)計學(xué)意義。各突變株與F蛋白的相互作用能力與野毒株相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義。N252A、R253A、K254A和C256A促進(jìn)F蛋白裂解的能力分別降低為野毒株的59.1％、17.3％、65.0％和13.2％。S257A的促細(xì)胞融合、受體結(jié)合和神經(jīng)氨酸酶活性與野毒株大體一致，其它各突變株的促細(xì)胞融合、受體結(jié)合和

29、神經(jīng)氨酸酶活性均有不同程度降低(P＜0.05)。除S257A外，其它突變株蛋白的半融合活性和促進(jìn)F蛋白啟動細(xì)胞膜融合的能力都有不同程度的降低。
　　 4.hPIV-3的HN蛋白三縮氨酸突變體的構(gòu)建及功能測定
　　 hPIV-3的HN蛋白三縮氨酸各突變體E409A、G410A、R411A、G476A、V477A、Y478A、Y530A、T531A和T532A都構(gòu)建成功。各突變株蛋白的促細(xì)胞融合活性都有不同程度的降低(P＜0

30、.05)。突變株細(xì)胞表面的蛋白表達(dá)效率及其與F蛋白的相互作用能力差別均無統(tǒng)計學(xué)意義。E409A、R411A、G476A、V477A、Y478A和H552A促進(jìn)F蛋白裂解的能力分別降低為野毒株的54.8％、35.5％、35.5％、31.4％、29.8％和11.8％。各突變株的受體結(jié)合活性、神經(jīng)氨酸酶活性、半融合活性和促進(jìn)F蛋白啟動細(xì)胞膜融合的能力均有不同程度降低（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.hPIV-3HN蛋

31、白的N308、N351和N5233個潛在的糖基化位點確實被N-糖基化修飾。
　　 2.N-糖基化位點單個突變和聯(lián)合突變后HN蛋白的受體結(jié)合和促細(xì)胞融合活性都有不同程度的降低，兩者降低程度成正比。
　　 3.hPIV-3的HN蛋白Ⅰ型受體結(jié)合/神經(jīng)氨酸酶活性位點中的保守氨基酸對HN蛋白的促細(xì)胞融合活性起著重要作用，第502位精氨酸(R)是關(guān)鍵氨基酸。
　　 4.第552位組氨酸(H)是Ⅱ型受體結(jié)合/神經(jīng)氨酸酶活性位

32、點內(nèi)的關(guān)鍵氨基酸。
　　 5.六縮氨酸NRKSCS是hPIV-3HN蛋白受體結(jié)合/神經(jīng)氨酸酶活性位點的組成部分，并且此區(qū)域內(nèi)除S257外的氨基酸突變會降低HN蛋白的促細(xì)胞融合活性，第253位精氨酸(R)是六縮氨酸的關(guān)鍵氨基酸。
　　 6.三縮氨酸對hPIV-3的HN蛋白促細(xì)胞融合活性有重要影響，其中T532為保守三縮氨酸內(nèi)的關(guān)鍵氨基酸。
　　 7.hPIV-3的HN蛋白與受體結(jié)合前后始終與F蛋白結(jié)合在一起形成HN