IGF-1通過(guò)線粒體信號(hào)途徑對(duì)感覺(jué)神經(jīng)再支配骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能維持的作用.pdf

1、骨骼肌(skeletal muscle，SKM)正常結(jié)構(gòu)和功能的維持是保證人體正常運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的最基本條件，蛋白合成和降解平衡的穩(wěn)定維持著SKM的正常結(jié)構(gòu)和功能，而這一平衡狀態(tài)的維持有賴于正常的神經(jīng)支配。當(dāng)失神經(jīng)支配時(shí)SKM蛋白合成與降解的平衡被打破，導(dǎo)致肌萎縮，并伴有一系列嚴(yán)重的臨床癥狀，如運(yùn)動(dòng)功能的喪失。在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損毀嚴(yán)重等特殊情況下，SKM的神經(jīng)支配無(wú)法及時(shí)恢復(fù)，長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)支配缺失會(huì)導(dǎo)致SKM收縮功能的喪失，即使SKM再次得到運(yùn)

2、動(dòng)神經(jīng)支配，其運(yùn)動(dòng)功能也無(wú)法恢復(fù)。因此，盡快恢復(fù)失神經(jīng)SKM的神經(jīng)支配至關(guān)重要。將感覺(jué)神經(jīng)近側(cè)端與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)殘端連接的感覺(jué)保護(hù)成為保護(hù)無(wú)法及時(shí)恢復(fù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)支配SKM的一種方案，但感覺(jué)保護(hù)的作用較弱，其治療效果有待進(jìn)一步加強(qiáng)。體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)均證實(shí)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）作為一種多功能的多肽類(lèi)生長(zhǎng)因子，可通過(guò)激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol

3、3-kinase，PI3K)/Akt信號(hào)通路延緩多種病理性肌萎縮并維持和促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)及存活，但I(xiàn)GF-1對(duì)SKM感覺(jué)保護(hù)是否有增強(qiáng)作用尚有待證實(shí)。已有研究表明，Akt激活能夠影響線粒體的功能狀態(tài)，而線粒體的功能與其形態(tài)密切相關(guān)，線粒體在分裂和融合狀態(tài)之間持續(xù)轉(zhuǎn)換，線粒體的異常形態(tài)會(huì)導(dǎo)致多種疾病。但I(xiàn)GF-1對(duì)SKM感覺(jué)保護(hù)模型中線粒體的影響尚無(wú)相關(guān)研究。本課題通過(guò)建立在體感覺(jué)神經(jīng)支配動(dòng)物模型和具有感覺(jué)神經(jīng)支配的SKM細(xì)胞體外聯(lián)合培

4、養(yǎng)模型，研究IGF-1對(duì)SKM感覺(jué)保護(hù)的作用及相關(guān)機(jī)制，本課題的研究結(jié)果將會(huì)為延緩失神經(jīng)肌萎縮的治療提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分：IGF-1增強(qiáng)在體感覺(jué)神經(jīng)再支配對(duì)骨骼肌的保護(hù)作用
　　如果SKM失去運(yùn)動(dòng)神經(jīng)支配的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，即使SKM再次獲得神經(jīng)支配，其運(yùn)動(dòng)功能也將無(wú)法恢復(fù)。在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷嚴(yán)重，無(wú)法及時(shí)恢復(fù)SKM神經(jīng)支配時(shí)，可將感覺(jué)神經(jīng)與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)殘端連接進(jìn)行修復(fù)，使失神經(jīng)支配SKM得到臨時(shí)的感覺(jué)神經(jīng)支配，這種技

5、術(shù)手段被稱為感覺(jué)保護(hù)。雖然運(yùn)動(dòng)功能仍無(wú)法恢復(fù)，但感覺(jué)保護(hù)可保護(hù)SKM的收縮功能及重要結(jié)構(gòu)，待運(yùn)動(dòng)神經(jīng)恢復(fù)至能夠正常修復(fù)后，再將運(yùn)動(dòng)神經(jīng)近側(cè)與遠(yuǎn)側(cè)殘端連接，使SKM運(yùn)動(dòng)功能逐步恢復(fù)。但感覺(jué)保護(hù)對(duì)失神經(jīng)SKM的作用程度有限，效果有待加強(qiáng)。IGF-1作為一種多功能多肽類(lèi)因子，對(duì)SKM和神經(jīng)系統(tǒng)均具有保護(hù)作用，但I(xiàn)GF-1能否增強(qiáng)SKM感覺(jué)保護(hù)的作用尚有待于進(jìn)一步研究。mtDNA數(shù)量的變化與線粒體正常功能的維持密切相關(guān)，而這種變化與SKM的功能

6、有密切的關(guān)系，而這些變化過(guò)程中IGF-1所扮演的角色，目前也不清楚。基于以上研究背景，本課題設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。取25只260±10 g的Wistar雄性大鼠，采用隨機(jī)分組的方法分為:(1)假手術(shù)組:在大鼠后肢作縱行切口，顯露坐骨神經(jīng)分叉部后縫合;(2)失神經(jīng)組:做同樣切口后離斷脛神經(jīng)，近側(cè)殘端結(jié)扎并縫入塑料帽后縫合;(3) IGF-1組:手術(shù)操作同失神經(jīng)組，脛神經(jīng)離斷后縫合刀口，術(shù)后8w時(shí)間內(nèi)每3d向腓腸肌多點(diǎn)注射10μgIGF-1

7、;(4)感覺(jué)保護(hù)組:作縱行切口后離斷脛神經(jīng)和腓腸神經(jīng)，將腓腸神經(jīng)的近側(cè)殘端和脛神經(jīng)的遠(yuǎn)側(cè)殘端縫合，脛神經(jīng)的近側(cè)殘端同樣縫合到塑料帽中，縫合刀口;(5) IGF-1+感覺(jué)保護(hù)組，手術(shù)操作同感覺(jué)保護(hù)組，IGF-1應(yīng)用時(shí)間、部位及劑量同IGF-1組。術(shù)后8 w收集腓腸肌組織樣本進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果表明，對(duì)肌萎縮最為直觀反映為肌濕重和肌橫截面積(cross-sectional area，CSA)，在失神經(jīng)組出現(xiàn)顯著下降，IGF-1組和感覺(jué)保護(hù)組增

8、加，而IGF-1+感覺(jué)保護(hù)組增加的幅度最大。SKM關(guān)鍵收縮蛋白肌球蛋白重鏈1(myosin heavy chain1，MyHC1)變化趨勢(shì)與腓腸肌肌濕重和肌橫截面積相一致，失神經(jīng)組下降最明顯，而IGF-1增強(qiáng)了SKM感覺(jué)保護(hù)的作用，使IGF-1+感覺(jué)保護(hù)組的MyHC1表達(dá)量較感覺(jué)保護(hù)組進(jìn)一步提高。同時(shí)，IGF-1不僅能夠直接提升失神經(jīng)SKM線粒體含量，而且IGF-1還可進(jìn)一步增強(qiáng)感覺(jué)神經(jīng)再支配對(duì)線粒體含量的上調(diào)作用。以上結(jié)果表明，感覺(jué)神

9、經(jīng)保護(hù)可延緩大鼠失神經(jīng)肌萎縮和線粒體數(shù)量的減少，在感覺(jué)神經(jīng)保護(hù)的基礎(chǔ)上應(yīng)用IGF-1后，可使感覺(jué)神經(jīng)保護(hù)延緩肌萎縮和線粒體數(shù)量減少的作用得到明顯增強(qiáng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探討IGF-1對(duì)SKM感覺(jué)保護(hù)的增強(qiáng)作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的思路。
　　第二部分：IGF-1對(duì)具有感覺(jué)神經(jīng)支配的骨骼肌細(xì)胞保護(hù)作用的體外培養(yǎng)研究
　　維持SKM正常運(yùn)動(dòng)功能的神經(jīng)支配的發(fā)生、發(fā)展和作用過(guò)程是極其復(fù)雜的。失神經(jīng)支配的SKM會(huì)即刻喪失其應(yīng)有的運(yùn)動(dòng)

10、功能，而且還由于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的缺失而導(dǎo)致SKM很快就會(huì)出現(xiàn)萎縮。為了研究延緩失神經(jīng)支配SKM的策略，本課題利用具有背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)元感覺(jué)神經(jīng)支配的SKM細(xì)胞模型，研究外源性IGF-1對(duì)SKM細(xì)胞直接作用或通過(guò)作用于支配SKM細(xì)胞的感覺(jué)神經(jīng)而改善SKM細(xì)胞狀態(tài)的新的治療策略。在Wistar新生鼠后肢SKM細(xì)胞培養(yǎng)2d后，取15d胎鼠器官型DRG來(lái)建立DRG組織塊和分散SKM細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)體

11、系，此培養(yǎng)體系將繼續(xù)培養(yǎng)4d。本課題的實(shí)驗(yàn)分組為:(1)對(duì)照組（SKM組），SKM細(xì)胞在SKM培養(yǎng)液中培養(yǎng)2d后更換為共培養(yǎng)體系培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 d;(2)聯(lián)合培養(yǎng)組，單純SKM細(xì)胞培養(yǎng)2d后加入DRG組織塊繼續(xù)共培養(yǎng)4d;(3) SKM+IGF-1組，SKM細(xì)胞在培養(yǎng)2d后，更換為共培養(yǎng)體系使用的培養(yǎng)液培養(yǎng)2d，然后在共培養(yǎng)培養(yǎng)液中加入IGF-1(20 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)2 d;(4)聯(lián)合培養(yǎng)+IGF-1組，單純SKM細(xì)胞培養(yǎng)2d

12、后，與DRG組織塊共培養(yǎng)2d，此后在聯(lián)合培養(yǎng)培養(yǎng)液中加入IGF-1繼續(xù)培養(yǎng)2d。通過(guò)免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)SKM細(xì)胞的長(zhǎng)度和表面積以衡量細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，通過(guò)檢測(cè)SKM關(guān)鍵收縮蛋白MyHC1的表達(dá)量以間接反映SKM細(xì)胞的收縮潛能，檢測(cè)mtDNA/nuDNA比值代表線粒體數(shù)量的變化，用MitoTrackerRed活體染料標(biāo)定線粒體的形態(tài)，檢測(cè)胞漿細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)表達(dá)量德量線粒體完整性。結(jié)果顯示，IGF-1可直接作用

13、于SKM細(xì)胞或通過(guò)作用于DRG感覺(jué)神經(jīng)元而間接影響SKM細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài);IGF-1可通過(guò)影響SKM細(xì)胞收縮性蛋白MyHC1的表達(dá)來(lái)改善SKM細(xì)胞的功能狀態(tài);IGF-1對(duì)SKM細(xì)胞線粒體數(shù)量、線粒體分裂/融合的動(dòng)態(tài)平衡以及線粒體完整性的維持等多個(gè)方面具有重要的促進(jìn)作用。以上結(jié)果表明，作為單因素作用的感覺(jué)神經(jīng)支配或IGF-1可對(duì)培養(yǎng)的SKM細(xì)胞狀態(tài)具有一定的影響作用，聯(lián)合應(yīng)用感覺(jué)神經(jīng)保護(hù)和IGF-1對(duì)SKM細(xì)胞的效果更為明顯。本課題的研究結(jié)

14、果為IGF-1對(duì)感覺(jué)保護(hù)的作用提供新的資料和觀點(diǎn)，為SKM細(xì)胞狀態(tài)和線粒體之間的關(guān)系補(bǔ)充了新的實(shí)驗(yàn)資料和依據(jù)。
　　第三部分IGF-1保護(hù)具有感覺(jué)神經(jīng)支配的骨骼肌細(xì)胞的線粒體信號(hào)途徑
　　IGF-1和感覺(jué)神經(jīng)支配對(duì)失神經(jīng)SKM具有確定的保護(hù)作用，對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間失神經(jīng)支配SKM運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)具有重要的指導(dǎo)意義，尤其是IGF-1通過(guò)增強(qiáng)感覺(jué)神經(jīng)支配信號(hào)而對(duì)SKM細(xì)胞的間接作用研究策略是本研究領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展方向，但I(xiàn)GF-1的這種

15、保護(hù)作用機(jī)制仍不清楚。但由于失神經(jīng)支配SKM狀態(tài)變化和功能喪失的嚴(yán)重性表現(xiàn)在多個(gè)方面，又由于IGF-1信號(hào)通路對(duì)SKM細(xì)胞作用靶點(diǎn)的不確定性，致使IGF-1通過(guò)增強(qiáng)感覺(jué)神經(jīng)支配信號(hào)改善SKM細(xì)胞狀態(tài)的機(jī)制探索帶來(lái)了一定的難度。本課題利用具有DRG神經(jīng)元感覺(jué)神經(jīng)支配的SKM細(xì)胞模型，通過(guò)檢測(cè)IGF-1激活的Akt通路及下游的相關(guān)靶點(diǎn)，并運(yùn)用相應(yīng)的激活/抑制劑和過(guò)表達(dá)載體研究相應(yīng)的機(jī)制。結(jié)果表明，感覺(jué)神經(jīng)支配并沒(méi)有激活SKM細(xì)胞的Akt通路

16、，感覺(jué)神經(jīng)保護(hù)對(duì)SKM細(xì)胞的改善可能是通過(guò)其他途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但I(xiàn)GF-1對(duì)感覺(jué)神經(jīng)-肌聯(lián)合培養(yǎng)的SKM細(xì)胞Akt磷酸化水平則有顯著的上調(diào)作用。通過(guò)用LY294002抑制Akt磷酸化，進(jìn)一步確認(rèn)Akt磷酸化水平的上調(diào)是IGF-1誘導(dǎo)的線粒體數(shù)量增加、線粒體融合增多、線粒體完整性改善、蛋白水解泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasomesystem，UPS)中泛素連接酶atrogin-1和肌環(huán)指蛋白Ⅰ(muscle RING

17、finger1，MuRF1)抑制、MyHC1蛋白表達(dá)量上升的關(guān)鍵步驟。與未給予IGF-1的感覺(jué)保護(hù)組相比，應(yīng)用IGF-1的感覺(jué)保護(hù)組SKM的Akt磷酸化水平的上調(diào)抑制了線粒體外膜蛋白線粒體E3泛素蛋白連接酶1(mitochondrial E3 ubiquitin proteinligase1，Mul1)的表達(dá)。為進(jìn)一步確認(rèn)Mul1在Akt對(duì)線粒體及下游改變中發(fā)揮的作用，通過(guò)構(gòu)建Mul1過(guò)表達(dá)載體，應(yīng)用于IGF-1孵育的聯(lián)合培養(yǎng)體系內(nèi)，證

18、實(shí)了Mul1過(guò)表達(dá)可抑制SKM細(xì)胞的Akt磷酸化水平升高誘導(dǎo)的線粒體狀態(tài)的改善、蛋白降解途徑抑制和SKM收縮蛋白表達(dá)的上調(diào)，確認(rèn)了Mul1可能為IGF-1下游作用于線粒體的重要靶點(diǎn)。IGF-1抑制Mul1，使SKM細(xì)胞線粒體狀態(tài)改善，能量產(chǎn)生增多，從而抑制了線粒體下游能量感受器5-磷酸腺苷依賴的蛋白激酶α(adenosine5'-monophosphate-activated protein kinaseα，AMPKα)的活化。通過(guò)應(yīng)用

19、1 mmol/L AMPKα激活劑5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-D-核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carbox-amide-1-D-ribonucleoside，AICAR)，進(jìn)一步確認(rèn)IGF-1改善線粒體能量產(chǎn)生后，抑制AMPKα活化，進(jìn)而減少atrogin-1mRNA、MuRF1 mRNA表達(dá)和促進(jìn)MyHC1蛋白表達(dá)。本課題的研究結(jié)果明確了在神經(jīng)-肌聯(lián)合培養(yǎng)體系中IGF-1對(duì)線粒體功能形態(tài)和SKM細(xì)胞狀態(tài)的進(jìn)一步

20、促進(jìn)作用的機(jī)制。IGF-1通過(guò)對(duì)其下游靶點(diǎn)Akt、Mul1以及AMPKα的調(diào)控來(lái)改善感覺(jué)神經(jīng)再支配SKM細(xì)胞的狀態(tài)。該途徑的主要調(diào)控機(jī)制為IGF-1誘導(dǎo)Akt磷酸化和抑制Mul1的表達(dá)，從而改善線粒體形態(tài)及功能狀態(tài)，最終通過(guò)抑制UPS關(guān)鍵分子atrogin-1和MuRF1的表達(dá)來(lái)增加收縮性蛋白MyHC1的合成。這些數(shù)據(jù)為通過(guò)調(diào)控IGF-1信號(hào)通路及線粒體改善長(zhǎng)期失神經(jīng)SKM細(xì)胞的功能狀態(tài)提供了全新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為該途徑的關(guān)鍵分子的研