ITGA1在結(jié)直腸腫瘤表達(dá)中的相關(guān)研究.pdf

1、目的：
　　探討整合素α1（ITGA1）在結(jié)直腸腺瘤癌組織、血清及5系結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)情況；構(gòu)建ITGA1過(guò)表達(dá)及抑制性載體，包裝慢病毒，體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ITGA1的表達(dá)水平變化對(duì)結(jié)直腸腫瘤癌生物學(xué)行為的影響。明確其在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制，判斷其是否可作為結(jié)直腸腫瘤治療新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.Western Blot檢測(cè)ITGA1在5種結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)其在結(jié)直腸正常、腺瘤、癌組

2、織中的表達(dá)情況，分析比較兩種表達(dá)情況，結(jié)合組織的臨床病理分型進(jìn)行分析。
　　2．免疫組織化學(xué)法（IHC）檢測(cè)結(jié)直腸腫瘤（CRC）患者正常組織及腫瘤組織中ITGA1的表達(dá)情況。
　　3.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)腫瘤患者及健康人群血清中ITGA1的濃度。
　　4．構(gòu)建ITGA1的過(guò)表達(dá)載體并包裝慢病毒，轉(zhuǎn)染NCM460（正常腸上皮細(xì)胞）細(xì)胞，構(gòu)建ITGA1的抑制表達(dá)載體并包裝慢病毒，轉(zhuǎn)染SW480（原位癌細(xì)胞）細(xì)

3、胞，并篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。
　　5．Transwell及劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)ITGA1對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響。
　　6．體外裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1.Western Blot檢測(cè)ITGA1在NCM460（正常腸上皮細(xì)胞）、SW480（原位癌細(xì)胞）、SW620（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細(xì)胞）、HCT116（原位癌細(xì)胞）、HT29（原位癌細(xì)胞）細(xì)胞系中的表達(dá)，通過(guò) ImageJ專(zhuān)業(yè)軟件分析后可以看

4、出，ITGA1在正常長(zhǎng)腸上皮細(xì)胞NCM460（灰度值310±4.3）中低表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞系SW480（灰度值949.4±48.3）、SW620（灰度值414.2±10.5）、HCT116（灰度值557.0±46.0）、HT29（灰度值367.4±2.4）中有不同程度的高表達(dá)，量化灰度值之后差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。
　　2.Western Blot檢測(cè)ITGA1在結(jié)直腸腫瘤患者正常組織、癌旁組織、腺瘤組織及腫瘤組織中的表

5、達(dá),通過(guò)ImageJ及Primer5.0專(zhuān)業(yè)軟件分析后可以看出ITGA1在正常組織（101.2±1.7）中低表達(dá)，在癌旁組織（307.2±56.7）、腺瘤組織（1015.0±13.8）及腫瘤組織（2749.0±15.7）中有不同程度的高表達(dá)，結(jié)果與細(xì)胞系表達(dá)情況一致。
　　3.Real-time PCR結(jié)果與Western Blot結(jié)果一致，驗(yàn)證了我們前期的實(shí)驗(yàn)成果。
　　4.免疫組化：正常組織ITGA1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為985±

6、683個(gè)/每視野，腫瘤組織ITGA1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為4888±2612個(gè)/每視野，正常組織與腫瘤組織中ITGA1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)直腸腫瘤組織中ITGA1陽(yáng)性強(qiáng)度：弱陽(yáng)性（+）7例，中等陽(yáng)性（++）21例，強(qiáng)陽(yáng)性（+++）12例。
　　5.ELISA：正常人群血清中ITGA1的濃度為（1.79±0.43）μg/ml，結(jié)直腸腫瘤患者血清中ITGA1的濃度為（4.19±1.82）μg/ml。正常人群與結(jié)直腸腫

7、瘤患者血清中ITGA1的濃度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。腫瘤患者血清樣本中ITGA1的濃度在性別，年齡，發(fā)病部位，Duke's分期（ABCD期），及結(jié)直腸腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（carcino-embryonic antigen CEA），CA125（糖類(lèi)抗原）中的濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在TNM（I，II，III，IV期）分期，CA199（糖類(lèi)抗原）中的濃度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腫瘤患者血清中ITGA1

8、的濃度與CEA之間存在著正相關(guān)關(guān)系（r=0.516）。與腫瘤標(biāo)志物 CA125（糖類(lèi)抗原），CA19-9（糖類(lèi)抗原）之間的相關(guān)性較低。
　　6.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ITGA1慢病毒，Western Blot檢測(cè)ITGA1在轉(zhuǎn)染病毒細(xì)胞中的表達(dá)情況，通過(guò)ImageJ專(zhuān)業(yè)軟件分析后可以看出，過(guò)表達(dá) NCM460細(xì)胞（592.9±65.9）較正常NCM460細(xì)胞（425.8±37.6）ITGA1的表達(dá)量升高，干擾SW480細(xì)胞（7.7±3.4）較正

9、常SW480細(xì)胞（120.9±4.8）ITGA1的表達(dá)量降低。說(shuō)明ITGA1在結(jié)直腸正常及腫瘤細(xì)胞中有一定的影響作用。
　　7.Transewll結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾性病毒后侵襲能力較正常SW480細(xì)胞有所降低。正常SW480細(xì)胞侵襲數(shù)目為（134±5），Anti-ITGA1-SW480細(xì)胞侵襲數(shù)目為（116±2），兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。說(shuō)明ITGA1對(duì)細(xì)胞的侵襲能力有所影響。
　　8.劃痕

10、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常NCM460細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)NCM460細(xì)胞遷移能力明顯高于正常NCM460細(xì)胞。與正常SW480細(xì)胞相比，Anti-ITGA1-SW480細(xì)胞遷移能力低于正常SW480細(xì)胞。差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。說(shuō)明ITGA1對(duì)細(xì)胞的遷移能力有所影響。
　　9.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)及免疫組化Ki67實(shí)驗(yàn)表明：正常腸上皮細(xì)胞NCM460成瘤組織中Ki67表達(dá)幾乎為陰性，過(guò)表達(dá)NCM460成瘤組織中有弱陽(yáng)性表達(dá)。SW48

11、0成瘤組織中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為（8187±2137），Anti-ITGA1-SW480成瘤組織中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為（7105±1994），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說(shuō)明ITGA1在細(xì)胞的成瘤過(guò)程中起著一定的作用。
　　結(jié)論：
　　ITGA1在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系、組織及血清中均高表達(dá)，抑制ITGA1的表達(dá)可相對(duì)降低腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移及增值能力，整合素α1（ITGA1）可能在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要的調(diào)控作用，并有可能作為抑